基于生物条形码末端延伸技术的电化学生物传感器

发布时间：2017-08-11 01:15

  本文关键词：基于生物条形码末端延伸技术的电化学生物传感器

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【摘要】：基于肿瘤生物标志物分子(如肿瘤相关DNA和蛋白质)的诊断技术在肿瘤的早期诊断中具有重要意义,与常用的肿瘤诊断方法比可更早实现诊断。然而这些生物标志物在临床样本中的含量极低,因此,开发灵敏度高和特异性强的检测技术很有必要。电化学生物传感器具有快速、高效、高灵敏度、构造简单、易于操作、便于小型化和规模化等优点,具有早期快速诊断的潜力,因此备受关注。为提高生物标志物的检测灵敏度,本论文设计和研究了基于核酸末端延伸放大技术的电化学DNA传感器和适体传感器。具体内容如下：一、基于核酸末端延伸放大的电化学DNA传感器构建了纳米生物条形码,结合核酸末端延伸反应和氧化还原酶对DNA检测信号进行放大,实现了目标DNA的高灵敏度检测。纳米生物条形码由金纳米粒子和5'端巯基标记信号探针组装而成。当目标DNA存在时,组装在金电极表面的3’端巯基标记捕获探针、目标DNA和纳米生物条形码结合形成夹心结构,然后在信号探针DNA的3'端以生物素标记dATP为底物进行末端延伸反应,延伸的长链上标记的生物素可与亲和素标记辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)结合,通过检测HRP催化底物产生的电化学信号可以实现目标DNA的高灵敏检测。条件优化后该传感器检测下限低于10finol/L,检测范围达到9个数量级,具有较高灵敏度,能够识别单个碱基错配,并且在血清模拟样本中也有较高的检出率。为了更进一步提高电化学DNA传感器的性能,利用末端延伸酶构建超分子DNA网,并以此实现了DNA的高灵敏度检测。组装在金电极表面的捕获探针捕获目标DNA后能提供3'末端,在末端延伸酶的催化作用下以生物素标记dATP为底物进行末端延伸反应,然后将末端延伸的长链与支链DNA进行杂交反应并提供更多3'末端,交替进行末端延伸和支链杂交过程,在多次循环结束后加入亲和素标记HRP,检测HRP催化底物产生的电化学信号可以实现目标DNA的高灵敏检测。所设计的超分子DNA网上布满生物素,对DNA的检测下限达到10fmol/L,在10fnol/L-100pmol/L的检测范围内呈线性,并且能够识别单个碱基错配,具有较好的血清样本检出率。二、基于核酸末端延伸放大的电化学适体传感器构建了双核酸适体夹心法的电化学适体传感器,利用核酸末端延伸技术和氧化还原酶对癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen, CEA)检测信号进行放大。两条核酸适体可同时与CEA结合形成夹心结构,其中一条通过3'端巯基标记组装在金电极表面可特异性捕获CEA,另一条为未修饰的核酸适体信号探针；然后在核酸适体信号探针3'末端进行延伸反应,延伸出标记多个生物素的长链与亲和素标记HRP结合,检测HRP催化底物产生的电化学信号实现CEA的定量检测。该传感器对CEA分子的检测下限低于10pg/mL,检测范围达到了6个数量级,并且具有较高的选择性和血清模拟样本检出率。在上述工作基础上,构建基于纳米生物条形码和核酸末端延伸技术的电化学适体传感器,进一步提高CEA的检测灵敏度。5'端巯基标记的核酸适体信号探针通过金-硫键自组装到金纳米粒子表面而形成纳米生物条形码。组装在金电极表面的3'端巯基标记核酸适体捕获探针、CEA和纳米生物条形码形成夹心结构,然后在核酸适体信号探针的3'端进行延伸反应生成多条标记生物素的长链DNA,结合亲和素标记HRP,检测HRP催化底物产生的电化学信号可以实现CEA的检测。所构建的传感器实现了CEA的高灵敏度检测,检测下限低于100fg/mL,检测范围达到了8个数量级,并且具有较好的选择性和血清模拟样本检出率。
【关键词】：电化学生物传感器 纳米生物条形码 末端延伸技术 DNA CEA
【学位授予单位】：南京理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.1;TP212.3
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1 绪论12-34
• 1.1 核酸扩增技术在生物检测方面的应用13-24
• 1.1.1 聚合酶链式反应13-16
• 1.1.2 常用等温核酸扩增技术16-24
• 1.2 纳米技术在生物检测方面的应用24-33
• 1.2.1 几种常见纳米材料24-27
• 1.2.2 金纳米粒子27-28
• 1.2.3 纳米生物条形码28-33
• 1.3 研究目的和意义33
• 1.4 研究内容33-34
• 2 基于纳米生物条形码和末端延伸技术的电化学DNA传感器34-45
• 2.1 引言34
• 2.2 实验部分34-38
• 2.2.1 实验试剂34-35
• 2.2.2 实验仪器35-36
• 2.2.3 所需溶液36
• 2.2.4 纳米生物条形码的制备36
• 2.2.5 基于纳米生物条形码和末端延伸技术的电化学DNA传感器的制备36-38
• 2.3 结果与讨论38-44
• 2.3.1 基于纳米生物条形码和末端延伸技术的电化学DNA传感器基本原理38
• 2.3.2 纳米生物条形码的制备结果38-39
• 2.3.3 基于纳米生物条形码和末端延伸技术的电化学DNA传感器可行性分析39
• 2.3.4 基于纳米生物条形码和末端延伸技术的电化学DNA传感器条件优化39-42
• 2.3.5 基于纳米生物条形码和末端延伸技术的电化学DNA传感器性能评价42-44
• 2.4 本章小结44-45
• 3 基于末端延伸酶构建的超分子DNA网的电化学DNA传感器45-55
• 3.1 引言45
• 3.2 实验部分45-47
• 3.2.1 实验试剂45-46
• 3.2.2 实验仪器46
• 3.2.3 所需溶液46
• 3.2.4 基于末端延伸酶构建超分子DNA网的电化学DNA传感器的制备46-47
• 3.3 结果与讨论47-53
• 3.3.1 基于末端延伸酶构建超分子DNA网的电化学DNA传感器的基本原理47-48
• 3.3.2 基于末端延伸酶构建超分子DNA网的电化学DNA传感器可行性分析48-49
• 3.3.3 基于末端延伸酶构建超分子DNA网的电化学DNA传感器条件优化49-52
• 3.3.4 基于末端延伸酶构建超分子DNA网的电化学DNA传感器性能评价52-53
• 3.4 本章小结53-55
• 4 基于双核酸适体夹心法和末端延伸技术的电化学适体传感器55-64
• 4.1 引言55
• 4.2 实验部分55-57
• 4.2.1 实验试剂55-56
• 4.2.2 实验仪器56
• 4.2.3 所需溶液56
• 4.2.4 基于双核酸适体夹心法和末端延伸技术的电化学适体传感器的制备56-57
• 4.3 结果与讨论57-63
• 4.3.1 基于双核酸适体夹心法和末端延伸技术的电化学适体传感器的基本原理57-58
• 4.3.2 基于双核酸适体夹心法和末端延伸技术的电化学适体传感器可行性分析58
• 4.3.3 基于双核酸适体夹心法和末端延伸技术的电化学适体传感器条件优化58-61
• 4.3.4 基于双核酸适体夹心法和末端延伸技术的电化学适体传感器性能评价61-63
• 4.4 本章小结63-64
• 5 基于纳米生物条形码和末端延伸技术的电化学适体传感器64-74
• 5.1 引言64
• 5.2 实验部分64-67
• 5.2.1 实验试剂64-65
• 5.2.2 实验仪器65
• 5.2.3 所需溶液65-66
• 5.2.4 纳米生物条形码的制备66
• 5.2.5 基于纳米生物条形码和末端延伸技术的电化学适体传感器的制备66-67
• 5.3 结果与讨论67-73
• 5.3.0 基于纳米生物条形码和末端延伸技术的电化学适体传感器的基本原理67
• 5.3.1 纳米生物条形码的制备结果67-68
• 5.3.2 基于纳米生物条形码和末端延伸技术的电化学适体传感器可行性分析68
• 5.3.3 基于纳米生物条形码和末端延伸技术的电化学适体传感器条件优化68-72
• 5.3.4 基于纳米生物条形码和末端延伸技术的电化学适体传感器性能评价72-73
• 5.4 本章小结73-74
• 结论74-76
• 致谢76-77
• 参考文献77-86
• 附录86-87

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本文编号：653551