血清叶酸及其相关代谢产物超高效液相色谱—串联质谱法建立及应用研究

发布时间：2017-10-23 08:39

  本文关键词：血清叶酸及其相关代谢产物超高效液相色谱—串联质谱法建立及应用研究

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【摘要】：背景:叶酸(folic acid,FA)是一种B族维生素,本身无生理功能,在体内二氢叶酸还原酶的作用下转变成二氢叶酸及四氢叶酸(tetrahydrofolate,THF),四氢叶酸是叶酸的活性形式,可作为一碳单位的载体参与体内的一碳单位代谢,生成甲基四氢叶酸,亚甲基四氢叶酸,次甲基四氢叶酸和甲酰四氢叶酸。通过一碳单位形式实现其生物效应,参与嘌呤和嘧啶单核苷酸的合成,通过S-腺苷蛋氨酸(S-adenosly methionine,SAM)循环为体内蛋白质、核酸等物质的甲基化反应提供甲基。因此,叶酸与体内的核酸代谢及调节,能量物质代谢及代谢调节等多种生理功能有着密切的关系。流行病学及实验研究表明,叶酸缺乏及代谢障碍严重影响人类健康,导致多种严重疾病,如出生缺陷、神经精神疾病、心血管疾病、肿瘤等,但其机制尚不清楚。所以,目前叶酸与人类健康的关系及其致病机理是基础科学和临床科学关注的重大课题。建立准确、高效、方便的测定叶酸及其代谢产物(叶酸、5-甲基四氢叶酸(5-methyltetrahydrofolate,5-MeTHF)、5-甲酰四氢叶酸(5-formyltetrahydrofolate,5-FoTHF)、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)、S-腺苷蛋氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine,SAH))的方法是进行叶酸研究的重要基础手段。目前,关于叶酸及其代谢产物的测定方法尚无统一标准。常使用的方法包括比色法,薄层层析法,毛细管电泳法,微生物检测法,同位素放射免疫分析法,气相色谱-串联质谱法以及高效液相色谱-串联质谱法等。以上方法在不同程度上存在耗时长,样本量大,灵敏度低等缺点,尚不能满足科研和临床应用需要。本研究针对前述方法存在的缺点,利用超高效液相色谱-串联质谱法(ultra high performance liquid chromatograpy-tandem mass spectrometer,UPLC-MS/MS)进行叶酸及相关代谢产物在不同样品中的测定和研究,拟建立一个高效、简便、灵敏且适用范围广泛的叶酸及相关代谢产物的检测手段。目的:研究和探索使用uplc-ms/ms技术测定血清和组织中叶酸及其相关代谢产物的可行性及检测条件,优化并建立一种叶酸及代谢物测定的新方法。方法:1.使用叶酸及相关代谢产物的标准品研究和建立各标准品的uplc-ms/ms分析条件及参数。比较三种不同的亲水色谱柱对叶酸及相关代谢产物的分离效果;分别研究不同色谱条件(流动相、洗脱模式、流速、柱温)和质谱条件(离子源、正负离子模式、检测模式、离子源温度、离子喷射电压、碰撞气体及雾化气体流量)下叶酸和相关代谢产物分离效果。2.使用正常人血清研究样品处理的条件,使用不同的有机溶剂(甲醇、乙腈、乙酸乙酯)对样品中蛋白质进行沉淀,观察沉淀蛋白效果;观察不同浓度的抗氧化剂组合对样品中叶酸及相关代谢产物的保护作用。使用不同浓度的血清标准品验证所建立方法的线性、检出限和定量限、日内和日间精密度、回收率和稳定性。3.应用50例正常和神经管畸形(neuraltubedefects,ntds)大样本样品进行验证试验,确立本研究uplc-ms/ms方法的测定标准和条件参数,并在动物组织中进行试验,研究本方法应用的广泛性。结果:1.标准品实验结果表明:1:9的乙腈/水可作为样品的工作液,流动相:a为0.1%甲酸,b为乙腈。梯度洗脱,梯度洗脱的程序设定为:0~1min,99.9%a~99.9%a;1~3min,99.9%a~82%a;3~4min,82%a~10%a;4~5min,10%a~10%a;5~6min,10%a~99.9%a。平衡时间设定为1min,总分析时间为7min。流速:0.4ml/min,柱温:40℃,进样量:5μl,电喷雾电离子源,正离子(esi+)模式,多反应监测模式,毛细管电压:3.0kv,离子源温度:150℃,去溶剂气的温度:400℃;碰撞气流量:0.13ml/min;锥孔气流量:30l/h,脱溶剂气流量:900l/h。在以上实验条件下,叶酸及相关代谢产物分离效果优良,灵敏度可达99.9%。色谱柱研究比较结果发现美国waters公司生产的acquityuplcbehc18柱(2.1mm×50mm,1.7μm)对样品的分离效果最好。2.使用标准品加血清实验结果表明:样品用甲醇沉淀处理效果最佳,用100μg/mL抗坏血酸,100μg/mL柠檬酸和15 mg/mL DTT(二硫苏糖醇)组成的抗氧化体系可有效保持叶酸和相关代谢产物的稳定性。3.在上述优化的色谱和质谱条件下,血清中六种化合物的保留时间均在3 min内,峰性良好,并且无杂峰的干扰,基线平稳。六种化合物叶酸、5-MeTHF、5-FoTHF、Hcy、SAM和SAH的线性范围分别是10~500 ng/mL,2~100 ng/mL,0.5~50ng/mL,50~2000 ng/mL,4~200 ng/mL,4~200 ng/mL,相关系数R2≥0.998,对应的检出限和定量限分别为0.05和0.20 ng/mL、0.05和0.15 ng/mL、0.05和0.20 ng/mL、0.05和0.50 ng/mL、0.20和0.50 ng/mL、0.10和0.20 ng/mL,日内和日间精密度良好相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于5.84%,加标回收率为90.1%-105.3%,稳定性良好(RSD≤2.60%)。4.检测正常组和NTDs组孕产妇血清中叶酸及其代谢相关的六种化合物含量对比,结果发现,与正常对照组相比,NTDs组血清样品中叶酸和SAM含量无明显变化(P0.05),5-MeTHF和5-Fo THF含量均有明显降低(P0.05),Hcy以及SAH浓度明显升高(P0.05),同时甲基化指数(SAM:SAH)降低。对正常对照组和NTDs组胚胎脑组织中叶酸及相关代谢产物含量进行检测,结果发现,与正常对照组相比,NTDs组胚胎脑组织样品中叶酸、5-MeTHF、5-Fo THF、SAM含量降低(P0.05),Hcy、SAH浓度升高(P0.05)。结论:本研究首次成功建立了测定血清样品中叶酸、5-MeTHF、5-Fo THF、Hcy、SAM、SAH六种化合物含量的高效的UPLC-MS/MS方法,并对此方法进行了NTDs孕妇血清及动物组织的验证。该方法具有样品量少(5 uL)、耗时短(7 min),成本低,灵敏度高、适用范围广等特点,可用于科研及临床大样本的检测。
【关键词】：叶酸 超高效液相色谱-串联质谱 血清叶酸检测 神经管畸形
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.1;O657.72
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 常用缩写词中英文对照表13-14
• 前言14-18
• 1 材料18-21
• 1.1 主要实验仪器18
• 1.2 主要试剂和样本18-19
• 1.3 主要溶液配制19-21
• 2 方法21-27
• 2.1 方法的建立21-22
• 2.2 样品的预处理22-23
• 2.3 方法的验证23-25
• 2.4 方法的应用25-26
• 2.5 统计学分析26-27
• 3 结果27-47
• 3.1 方法的建立27-34
• 3.2 样品的预处理34-42
• 3.3 方法的验证42-45
• 3.4 方法的应用45-47
• 4 讨论47-53
• 4.1 方法建立的必要性47-48
• 4.2 方法建立过程中的优化48-50
• 4.3 方法建立在NTDs的应用50-53
• 5 总结53-55
• 6 展望55-56
• 参考文献56-62
• 综述62-72
• 参考文献68-72
• 致谢72-73
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果73-74
• 个人简历74

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本文编号：1082448