用于人造血干细胞体外扩增的小分子化合物筛选及作用机制研究

发布时间：2018-02-23 12:57

本文关键词： 单细胞造血干细胞小分子化合物筛选抗氧化小分子化合物造血干细胞　出处：《北京协和医学院》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：实验背景：造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)是目前研究最为深入的一类干细胞,它具有自我更新及多向分化两大重要特点,能够在保持干细胞池相对稳定的同时增殖分化为复杂造血系统中的各系血细胞。然而,HSCs在骨髓及脐带血中比例极低,基础研究及临床移植中用到的HSCs又多为异质性的细胞群体,即HSCs及定向分化的造血祖细胞混合体,虽然脐带血的应用大大降低了临床用造血干细胞对组织相容性抗原(HLA)的要求,但脐带血仍无法满足成人移植所需的造血干细胞量。基于此,临床移植面临HSCs数目不足及移植用HSCs无统一的质量标准等问题亟待解决。小分子化合物在HSCs调控领域以其浓度可精确调控、结构多样方便优化、易于处理等特点显示出极大优势,已有研究证实,SR1及UM71两种小分子化合物单独使用及组合使用均可显著扩增HSPCs(hematopoietic stem/progenitor cells),其扩增倍数可达到100倍以上。近年兴起的单细胞技术,可有效解决细胞异质性问题,细胞表面标记研究结合先进的流式细胞分选平台,使得纯化获取单个hHSC成为可能。已有研究表明,造血干细胞的表面标记除了经典的CD34、CD38外,CD90、CD45RA以及HSCs特异性标记CD49f,的表面标记组合可将HSCs与造血祖细胞充分区分开来,从而获得单纯的HSCs。体外造血功能实验CFC(colony forming cells)及 CAFC(cobblestone area forming cells)可用于体外验证HSCs功能,其中CFC侧重于观测多能祖细胞的分化能力,CAFC可反映培养系统中具有长期造血重建能力的HSCs。实验目的：本研究主要通过利用对HSCs有明显扩增作用的小分子化合物SR1及UM171,构建多参数单细胞的流式分选及培养体系,通过对分选得到的单个hHSC体外培养后流式检测及形态分析,以及体外造血功能实验,验证本单个hHSC体外培养体系的稳定性和可靠性,以便用于后续调控HSCs功能的小分子化合物筛选。实验方法：首先,我们通过CD34+细胞体外培养确定SR1及UM171的使用浓度,再通过实验摸索得到单细胞培养最适宜的培养基体系,利用BD INFLUX流式分选仪将单个DAPI-CD34+CD38+CD90+CD45RA-CD49f+细胞分选到96孔板中进行14d体外培养,并完成培养后流式分析及细胞形态检测,分析单个hHSC培养体系中小分子化合物的作用。利用经典的体外造血功能实验作一对比,以此验证体系的稳定性。结果：CD34+细胞体外培养确定了化合物使用浓度为SR1(1μmol/L), UM171 (35nmol/L),SR1+UM171(750nmol/L+35nmol/L)。单个hHSC体外培养14天流式结果显示,化合物处理组较对照组相比,有效孔数明显增加,在各孔细胞总数无明显差异的情况下,化合物处理组CD34+细胞及CD34+CD49f细胞绝对数及比例显著增高(P0.05),几乎所有有效孔细胞均向髓系、淋系两大方向分化,未出现偏系分化,细胞染色结果与流式检测结果一致。CFC结果显示,处理组克隆总数及各种克隆数目较对照组显著增加,且克隆形态及各种克隆比例无差异。CAFC泊松分布结果表明,处理组HSCs频率较对照组明显上升(P0.05)。结论：此构建的单个hHSC体外培养体系可保证SR1及UM171处理条件下,HSC保持自我更新同时仍具有多向分化潜能,缩短了体外扩增及验证性实验周期,初步解决了HSCs研究面临的异质性问题,为之后筛选靶向HSC的小分子化合物奠定了基础。实验背景：HSCs在早期发育及生命过程中,发挥着维持组织稳态等生理学功能。其自我更新及多向分化两大特性之间的平衡,对于HSCs的功能起着至关重要的作用。近年来对于胚胎干细胞及成体干细胞的研究发现,这一平衡可以由活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)来调节,ROS可以改变细胞内的氧化还原状态,实现代谢的同步性。但是,研究证实,HSCs在低氧环境生存,较低的ROS水平可以帮助维持长期HSCs的生物学功能,提高移植成功率。HSCT不仅需要保证细胞的功能,还需要有用于移植的足够数量的细胞,这也是急需解决的一个问题。人体的抗氧化防御系统是一个复杂的系统,它能够维持较低的ROS水平,同时确保机体内的ROS作为第二信使行使信号传导功能,此系统如不能完成恰当的氧化还原调控,可能会造成ROS水平升高导致氧化应激发生,需要有外界抗氧化物介入调节。实验目的：通过对抗氧化小分子化合物库中的85种小分子化合物进行筛选,得到对HSCs有明显体外扩增作用的几种小分子化合物,并初步验证其对HSCs生物学功能的影响,进而研究其抗氧化作用机制。实验方法：首先由于小分子化合物库中的抗氧化物在HSCs领域未有报道,需要利用CD34+细胞体外扩增的方法,确定化合物的使用浓度,经过初筛以及设计化合物浓度梯度,体外培养后流式分析CD34+细胞及CD34+CD49f+细胞绝对数及比例,得到合适的化合物浓度。通过体外造血功能实验CFC(细胞集落形成实验,colony forming cell assay)验证其对HSCs自我更新及多向分化两大方面的影响。结果：初步筛选85种抗氧化小分子化合物得到对CD34+细胞以及CD34+CD49+细胞均有显著作用(P0.05)的9种化合物,分别为C2968 (5μM)、B1753 (20μM)、 B3358 (10μM)、C0168 (10μM)、D3331 (5μM)、B8071 (20μM)、B8174(10μM)、 C0263 (20μM)、C2943 (10μM) 。综合化合物浓度及扩增效果两方面因素选取C2968(5μM)、B1753 (20μM)、B3358 (10μM)、C0168 (10μM)、D3331 (5μM)五种小分子化合物进行浓度梯度实验,确定使用浓度。细胞集落形成实验CFC结果显示化合物C2968 (0.5μM)、B1753 (1.5μM)、B3358 (15μM)、D3331(1.5μM)处理组较对照组而言,细胞的集落形成能力显著增强(P0.05),化合物处理可维持各类血细胞的祖细胞多向分化潜能,特别是多能祖细胞的造血能力。结论：抗氧化小分子化合物C2968 (0.5μM)、B1753 (1.5μM)、B3358(15μM)、 D3331 (1.5μM)具有较好的HSCs体外扩增效果,在维持HSCs自我更新的同时能够保证其多向分化潜能不受影响。C2968 (0.5μM)、B1753 (1.5μM)、B3358 (15μM)、 D3331 (1.5μM)可以作为HSCs体外扩增的新工具,帮助了解HSCs内的抗氧化机制,为基础研究领域HSCs扩增及生理学功能研究,以及HSCs临床移植提供新的方向。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R457.7

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