深度测序用于临床微生物检测的方法研究

发布时间：2018-05-22 18:10

本文选题：深度测序 + 临床诊断　；参考：《安徽医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称深度测序,下一代测序技术[1](Next-generation sequencing technology,NGS),在过去十年中快速发展。测序通量变大、测序速度变快、测序质量变高[2],测序成本已由1亿美金降至1000美金甚至正在往100美金靠近。这些重大变革改变了传统基因组的分析方法并为NGS临床微生物检测开拓了领域[3]。NGS对微生物学的影响是革命性的,不再依赖分离培养而是使用宏基因组学和微生物组学研究宿主和微生物之间的相互作用[4]。近年来有越来越多的医学文献报道将这种新技术用于传染病诊断和病原体分析方面,一些病例报告和临床研究[5]也显示了NGS作为单一诊断未知病原体引起的感染性疾病的工具,具有强大的潜力和适应性。实验人员仅需采血1~2 mL,在2个工作日内即可完成临床标本的病原体鉴定、分型、耐药基因和毒力因子检测[6],可以对重大公共卫生事件做出及时应对和控制。尽管越来越多的科研人员应用基于测序的实验技术研究疾病的病理生理学[7]、流行病学和临床诊断学,但由于一些技术上的挑战,例如临床样本的前处理、测序策略的选择、数据的分析,而且缺乏适用的市场监管指南,在医疗实践中推广NGS还是一个缓慢的过程。2016年5月13日,美国食品药品监督总局(Food and Drug Administration,FDA)公布了NGS感染病诊断指南草案,指出NGS直接检测可以用于微生物鉴定,抗菌药物耐药性和毒力标志物的检测,推广到临床需要监督管理,需要加大关注临床NGS产品的特异性、敏感性、最低检测线、可重复性以及质量控制。这也是一个将NGS从实验室推广到临床的重大转折点,一旦市场监督规范化,测序成本降低,NGS会给临床诊断疾病带来更多的帮助。本研究检测了三例未知病原体感染标本,我们使用Ion Torrent PGM测序平台[8]进行测序,对不同类型的标本采用不同的前处理方法,如使用痰消化液处理痰液标本,去除宿主细胞,提取核酸、富集病原体,然后进行文库构建,测序后使用自主研发的高通量测序数据病原体归类分析软件V1.0将测序数据转变为临床可行性报告。通过对样本的测序分别发现了细菌Bacillus cereus、病毒Hepatitis C virus和真菌曲霉菌,经过分离培养鉴定和实时荧光定量PCR[9]等方法进行验证,然后为临床治疗提供及时有效的信息。MDA是一种使用Phi29 DNA聚合酶的扩增方法,Phi29 DNA聚合酶可以对环状DNA和线性DNA进行滚环扩增,即多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)。MDA是近年来发展较快的一种全基因组扩增方法,可以用来非特异性扩增核酸达到文库构建的要求。此外,本研究从33份血液标本中提取病毒核酸,使用多重置换扩增技术富集指环病毒,然后使用Ion Torrent PGM平台进行高通量测序,进行生物信息学分析。共得到226个新的指环病毒序列,包括130条全序和96个ORF1(Open Reading Frame,ORF)。受检血液标本均检出Torque teno virus(TTV)、Torque teno midi virus(TTMDV)和Torque teno mini virus(TTMV)等指环病毒,显示我国人群普遍携带指环病毒。13.27%的序列在NCBI的核酸数据库中同源比对未成功,说明病毒序列多样性高,临床意义有待研究。TTV分为5个基因型:基因1-5型,进化分析显示基因2型是基因3型的子分枝,这一结果提示基因3型应划归基因2型。综上所述,本研究采用了不同的样本前处理方法处理不同来源的临床标本,使用Ion Torrent PGM测序平台进行测序,通过自主研发的高通量测序数据病原体归类分析软件V1.0对病原体进行快速筛查分析,筛查标本感染的病原体种类、型别、毒力基因和耐药基因,还可以研究进化关系以及与宿主的相互作用,为临床治疗提供信息与指导。随着测序技术的不断发展,NGS会给临床带来更多的帮助,随着测序成本的降低,NGS也会更多应用于临床。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R446.5

【参考文献】