MagiC-TT介导干细胞靶向植入骨髓对细胞体内分布和造血重建影响的研究

发布时间：2018-11-25 09:48

【摘要】：研究背景造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)是指通过大剂量放射治疗(简称放疗)和化学治疗(简称化疗)预处理,清除受者原有的造血/免疫系统,再通过输入自体或异体造血干细胞,使受者重建正常造血及免疫系统。HSCT是一种成功的器官移植模式,根据来源不同,可分为自体移植和异基因移植。异基因HSCT是目前多数恶性血液病、某些实体肿瘤和遗传性疾病患者唯一的根治手段[1.3]。HSCT后,绝大多数移植并发症和死亡发生于造血和免疫重建之前,快速、稳定的造血重建是免疫重建最基本、最关键的一步,所以,造血系统快速、有效地重建意义重大,可直接影响移植患者的生存率和生存质量。目前,细胞治疗主要采用静脉输注途径,细胞在到达靶组织前会首先分布在整个身体内。例如,在HSCT后的第一个20 h内,只有(1.56±0.32)%的造血细胞归巢至骨髓,绝大多数的移植细胞会首先滞留在肺循环、肝脏和脾脏中——显然,造血细胞归巢至骨髓是其重建造血系统的前提,提高细胞靶向植入骨髓的效率可以提高移植的效果。尽管众多研究者们曾经尝试使细胞定向迁移至靶组织,但并未突破细胞移植效率低的难题。究其原因,骨具有特定的解剖结构和生理环境,若仅依靠微环境中的各种因子、受体的调节和趋化作用等,输入骨组织的移植细胞很难在有效时间内在骨髓内归巢、聚集并在“造血龛位”中发育生长。如何高效地实现细胞的靶向植入?本课题组率先提出了磁力诱导细胞靶向移植(Magnetism-induced cell target transplantation, MagiC-TT)这一细胞治疗新策略并获得国家基金(基金号：30901367)。MagiC-TT——首先使细胞获得磁性,再在靶器官(如骨髓)局部短期施加一个适宜参数的磁场,磁化的细胞进入靶器官后,会被吸引在局部并定植下来,此时再撤去磁场,细胞可继续增殖、分化或迁移至其它部位。MagiC-TT通过减少细胞迁移至靶组织的时间,以及增加供体细胞在靶器官的局部浓度来提高细胞植入的效率。HSCT中最重要的细胞包括造血干/祖细胞(Hematopoietic Stem/Progenitor Cells, HS/PCs)及参与形成造血微环境的间充质干细胞(mesenchymal stem cells-MSCs)。HS/PCs是干细胞研究与应用领域中开展最早,也是迄今研究最为深入的一种成体干细胞,其在HSCT、基因治疗、免疫治疗及体外制备血液产品等方面有着极其重要的价值。而MSCs是一种成熟的、成纤维样多能细胞,来源于发育早期的中胚层,能够分化成脂肪细胞、神经细胞、心肌细胞、软骨细胞和成骨细胞等。MSCs还能够迁移至靶器官或靶组织,且分泌大量的免疫调节、抗炎、抗凋亡、促血管生成、趋化因子等生物活性分子,因此在众多疾病的治疗中有广泛的用途。故本课题分别采用HS/PCs和MSCs,研究MagiC-TT对干细胞靶向移植的作用。研究目的1、在体外,以Fe3O4@PDA@Au纳米颗粒磁化RFP-MSCs,比较研究磁化对RFP-MSCs生物学特性的影响；2、在体内,以MagiC-TT介导磁化RFP-MSCs植入小鼠骨髓,探讨其骨髓靶向移植的效果及对RFP-MSCs在体内分布与存活的影响；3、在小鼠自体HSCT模型中,以MagiC-TT介导磁化HS/PCs靶向植入骨髓,探讨其对造血重建的影响。研究内容第一部分Fe3O4@PDA@Au纳米颗粒磁化RFP-MSCs及MagiC-TT介导磁化细胞体外靶向迁移的研究[方法](1)使用Fe3O4@PDA@Au纳米颗粒磁化红荧光蛋白基因修饰的间充质干细胞(red fluorescent protein gene modified mesenchymal stem cell, RFP-MSCs),分选磁化细胞并测定细胞磁化阳性率；(2)比较研究磁化和野生型RFP-MSCs的细胞形态、增殖、分化及免疫表型等,探讨Fe3O4@PDA@Au纳米颗粒的生物安全性和相容性；(3)探究在外加磁场条件下,磁化和野生型RFP-MSCs的细胞迁移(垂直、水平、逆重力迁移和生长的)能力；(4)体外分离小鼠股骨,分为磁化细胞组和对照组,分别注射经新霉素耐药基因和荧光素酶基因修饰的磁化RFP-MSCs (NeoR-Luc-RFP-MSCs)和未磁化的NeoR-Luc-RFP-MSCs,通过生物发光成像系统观察两组荧光细胞随磁场位置变化而迁移的情况。[结果](1)Fe3O4@PDA@Au纳米颗粒磁化RFP-MSCs阳性率为(85.36±1.24)%。(2)磁化和野生型RFP-MSCs在细胞形态、增殖、分化及免疫表型方面无差异；纳米颗粒位于RFP-MSCs细胞表面及细胞内； (3)在外加磁场条件下,磁化NeoR-Luc-RFP-MSCs具有定向迁移能力,而未磁化NeoR-Luc-RFP-MSCs则无；(4)通过生物发光成像系统,可观察到磁化细胞组的NeoR-Luc-RFP-MSCs可随着磁场的位置移动。[小结]本部分实验证明：Fe3O4@PDA@Au纳米颗粒具有良好的生物安全性和相容性；在体外,MagiC-TT法可成功地实现磁化细胞的定向迁移及生长,为体内实验奠定基础。第二部分MagiC-TT介导Fe3O4@PDA@Au纳米颗粒磁化的细胞对骨髓靶向移植的效果及对细胞体内分布与存活的影响[方法](1)NeoR-Luc-RFP-MSCs体内实验：野生型BALB/c小鼠随机分为磁场组(M组)和对照组(C组),每组4只,分别经股骨注射磁化的NeoR-Luc-RFP-MSCs,使用生物发光仪观察两组小鼠体内荧光在不同时间点的变化；(2)RFP-MSCs体内实验：20只增强绿色荧光蛋白(enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP)转基因C57BL/6雌性小鼠,均随机分为M组和C组(每组10只),在X线引导下股骨穿刺,向两组小鼠股骨骨髓腔中注射经Fe3O4@PDA@Au纳米颗粒磁化的RFP-MSCs,但分别加与不加磁场(M组和C组)；通过流式细胞术、荧光定量PCR、病理切片和自创的半固体脱钙(semi-solid decalcification, SSD)技术,研究细胞在体内的骨髓靶向移植效果,以及细胞在体内的分布和存活。[结果](1)小动物活体成像仪结果显示,在细胞注射后5 min时,C组的RFP-MSCs在肺脏开始聚集,股骨处荧光逐渐减弱；而M组的荧光可局限在小鼠的股骨处,若在固定磁场1h后撤去磁场,5 min后M组小鼠肺脏出现荧光,15 min时荧光达到高峰； (2)普通冰冻切片、流式细胞术、荧光定量PCR和SSD技术观察结果显示,M组的骨髓中可见大量的RFP-MSCs;而C组小鼠骨髓中则很少见到RFP-MSCs,细胞主要分布在肺、肝、脾等脏器中；(3)病理技术尤其是SSD处理后的病理学检查,清晰地显示了移植后骨髓内红/绿荧光细胞(即供、受者细胞)的位置、形态及相互作用关系等；(4)磁化的RFP-MSCs可以在两组小鼠不同的器官和组织中存活至少3个月。[小结]本部分实验表明：(1)在M组小鼠体内,MagiC-TT法可成功地实现磁化RFP-MSCs的靶向迁移,而在早期撤去M组小鼠的磁场后,磁化细胞可在体内迁移； (2)RFP-MSCs在C组小鼠体内主要分布在肺、肝、脾等脏器中,骨髓中分布较少；(3)磁化细胞在小鼠体内未见明显毒性,可在体内长期存活。第三部分MagiC-TT法介导造血干/祖细胞在小鼠自体HSCT模型中促进造血重建的研究[方法](1)移植细胞数量梯度实验：60只C57BL/6受者雌性小鼠,随机分为6组,每组10只小鼠,分别经股骨移植(5×106、1×106,1×105的3个梯度)和尾静脉移植(5×106、1×106,1×105的3个梯度)造血干/祖细胞。各组小鼠移植前经7.5 Gy直线加速器进行清髓性放疗,观察各组生存率等,确定后续使用的移植细胞数量。(2)造血干/祖细胞股骨靶向移植实验：34只C57BL/6雌性普通小鼠作为受者,随机分为2组,每组17只,两组小鼠经7.5 Gy清髓性放疗后,分别于右侧骨髓腔中输注0.02 ml经磁化的来源于GFP C57BL/6小鼠的造血干/祖细胞悬液(1×106)/只,并分别于右侧股骨外加磁场(M组)或不加磁场(C组),一定时间后撤去。流式细胞术检测细胞输注后不同时间点(0h、24 h、72 h)处死的两组小鼠(各3只),比较左右股骨中GFP+细胞数量和比例有无统计学差异：观察两组剩余小鼠(每组8只)的一般情况、血常规变化、外周血GFP+细胞嵌合率等,并使用病理切片、SSD、荧光定量PCR法等探究GFP+细胞的体内分布等。[结果](1)移植细胞数量梯度实验：尾静脉移植组,输注5×106个细胞的小鼠6/10只存活,输注1×106和1×105个细胞的小鼠均死亡；而股骨移植组中,输注5×106个细胞的小鼠均存活,输注1×106个细胞的小鼠2只存活,1×105的小鼠均死亡；根据实验结果,以后实验中每只小鼠移植1×106个细胞。(2)造血干／祖细胞股骨靶向移植实验：①M组和C组小鼠于清髓性放疗后体重进行性下降,精神状态欠佳,1周后部分小鼠体重、精神、活动逐渐恢复。②2组小鼠的生存情况分别为：M组7/8小鼠的生存时间30d；而C组小鼠30d时存活1/8只,平均生存时间(12.43±5.13)d,两组小鼠生存有统计学差异(P0.05)。③两组小鼠造血基本恢复时,外周血中GFP+比例分别为(94.10±1.97)%和93.82%,表明HSCT造血重建成功。④细胞输注后0h、24h、72h,流式检测两组小鼠左右股骨中GFP+造血干/祖细胞结果显示：a.组内比较：M组小鼠各时间点股骨中GFP+细胞比例,均是注射细胞侧股骨多于对侧股骨(P0h=0.040, P24h=0.030, P72h=0.049);而C组各时间点的GFP+细胞比例在注射细胞侧与对侧股骨无显著统计学差异(P0h=0.184, P24h=0.184, P72h=0.368)。b.组间比较：注射细胞侧股骨中的GFP+细胞比例,M组小鼠在三个时间点均多于C组,且有显著统计学差异(Poh=0.007, P24h=0.006, P72h=0.036);而比较M组和C组的对侧股骨GFP+细胞比例则无显著统计学差异(P0h=1.000, P24h=0.083, P72h=0.108).⑤ M组小鼠血小板恢复时间较C组快(12.33±2.42) d vs (16.38±2.39) d,P=0.009;且M组小鼠移植后血红蛋白的最低值较C组高(43.75±13.02) g/L vs (13.75±5.18) g/L,P0.001。⑥病理技术尤其是SSD体系处理后的病理学检查,清晰地显示了移植后骨髓内供受者细胞的位置、形态及相互作用关系等,M组小鼠细胞注射侧股骨内可见大量GFP+细胞,而C组则很少。[小结]本部分实验采用eGFP荧光蛋白转基因小鼠同基因HSCT的模型,探讨了MagiC-TT对小鼠移植后造血恢复的影响。结果表明MagiC-TT能够实现磁化造血干／祖细胞的股骨靶向移植,可缩短移植后小鼠造血恢复时间,提高了生存率。全文总结本实验采用自创的MagiC-TT技术及Fe3O4@PDA@Au NPs新型纳米磁化颗粒,通过RFP-MSC的体内、外实验及HS/PCs小鼠同基因HSCT实验,探究了MagiC-TT对干细胞体内分布的作用及对造血恢复的促进作用,并通过SSD等技术平台,探讨了靶向移植后细胞的归巢、增殖和相互作用等机制,从而为MagiC-TT技术的进一步发展打下了坚实基础。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R457.7

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