【摘要】：沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)是严格活细胞内寄生、且具有独特的发育周期的微生物。通过性传播感染泌尿生殖道,可引起女性盆腔炎、宫外孕和不孕不育等,引起学者高度关注。CT感染开始于原体(EB)进入宿主细胞,在胞浆液泡内(包涵体)迅速分化成网状体又称始体(RB),RB复制后分化成EB感染相邻细胞。CT的整个生物合成过程是在包涵体内完成的,为了维持自身发育生长,CT需通过包涵体膜与宿主细胞间进行物质交换与信息传递。在此过程中,包涵体膜发挥很重要的生物学作用。包涵体膜蛋白(inclusion membrane protein,Inc)是包涵体的重要组成成分,由衣原体基因编码,具有特异性的蛋白质。研究发现,Inc的N末端和C末端均在宿主细胞浆,N末端具有III型分泌信号,C末端至少具有两个跨膜螺旋亲水区域。当RB形成时,Incs可通过III型分泌系统(T3SS)分泌表达,对于衣原体的生长、发育发挥重要的作用,故对于Incs的研究尤为重要。目前推测CT有多于50个假定的包涵体膜蛋白。其中,CT813是被预测并经过证实的包涵体膜蛋白之一,初步研究揭示其在CT感染的泌尿系统疾病的女性中具有免疫原性并可诱导宿主产生免疫反应,但CT813的具体生物学功能尚不清楚。为此,我们对CT813进行了进一步研究,前期实验运用酵母双杂交技术筛选出与CT813相互作用的分子,包括环腺苷酸应答原件结合蛋白3(CREB3)、半乳糖凝集素-1(LGALS1)、核糖体蛋白L10a(RPL10a)和微管蛋白37E-16(RP1-37E16)。本研究采用细胞共定位技术与免疫共沉淀技术对CT813与CREB3分子间是否存在相互作用做进一步鉴定。首先,根据Genbank中CT813与CREB3的核酸序列设计引物,分别扩增目的片段CT813与CREB3,构建重组表达载体pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813与pcDNA3.1+/Flag-CREB3,采用双酶切、菌落PCR、基因测序对上述重组载体进行验证。其次,运用亚细胞共定位技术验证CT813与外源性的CREB3间是否存在相互作用。将重组表达载体pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813与pcDNA3.1+/Flag-CREB3共转染HeLa细胞(实验组),同时将pcDNA3.1+/Myc-His A空质粒与pcDNA3.1+/Flag-CREB3(对照组)共转染HeLa细胞,经过24h,固定(丙酮)、封闭(山羊血清)、一抗孵育(小鼠抗Myc单克隆抗体,兔抗CREB3单克隆抗体)、洗涤、二抗孵育(羊抗小鼠IgG-Cy3抗体,羊抗兔IgG-FITC抗体)、避光洗涤、染核(DAPI)、避光洗涤、封片(抗荧光淬灭剂封片),在激光共聚焦显微镜下观察,结果表明实验组中CT813显有红色荧光,CREB3显有绿色荧光且二者间发生重叠,重叠部分为黄色荧光;对照组中,CREB3显现绿色荧光,其与标签Myc没有发生重叠,实验组与对照组的结果CT813与外源性CREB3存在相互作用。再次,运用免疫共沉淀技术验证CT813与外源性的CREB3间是否存在相互作用。将重组表达载体pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813与pcDNA3.1+/Flag-CREB3(实验组)共转染HeLa细胞,将pcDNA3.1+/Myc-His A空质粒与pcDNA3.1+/Flag-CREB3,共转染He La细胞,将pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813转染HeLa细胞(对照组),经过48 h后将细胞裂解(冰上裂解30 min),离心,吸附(上清用Anti-c-Myc agarose吸附)、洗涤、制备样品、Western blot检测(电泳、转膜、封闭、孵育抗体、洗涤、孵育二抗、洗涤、ECL发光);未转染HeLa细胞裂解后做β-actin的Western blot检测(β-actin对照组)。结果显示:实验组中在33 kD与46 kD处分别具有条带,大小与CT813、CREB3的分子量相符;对照组中,空质粒与pcDNA3.1+/Flag-CREB3共转染组无条带,pcDNA3.1+/Myc-His A-CT813转染组在33 kD处出现条带;β-actin组在43 kD即处有条带。由上说明CT813与外源性CREB3发生相互作用。最后,运用亚细胞共定位技术验证CT813与内源性的CREB3间是否存在相互作用。CREB3是亮氨酸拉链c AMP反应结合蛋白家族内的一种转录因子,位于内质网,故选取内质网钙联结蛋白(calnexin)作为参照。将HeLa细胞进行固定(丙酮)、封闭(山羊血清)、一抗孵育(小鼠抗calnexin单克隆抗体,兔抗CREB3单克隆抗体)、洗涤、二抗孵育(羊抗小鼠IgG-Cy3抗体,羊抗兔IgG-FITC抗体)、避光洗涤、染核(DAPI)、避光洗涤、封片(抗荧光淬灭剂封片),在激光共聚焦显微镜下观察,显有红色荧光的calnexin与显有绿色荧光的CREB3,且二者间发生重叠,即重叠部分为黄色荧光,进一步印证CREB3是位于内质网上的。将pcDNA3.1+/Myc-His A-CT 813重组表达载体转染HeLa细胞(实验组),经过24h,固定(丙酮)、封闭(山羊血清)、一抗孵育(小鼠抗Myc单克隆抗体,兔抗CREB3单克隆抗体)、洗涤、二抗孵育(羊抗小鼠IgG-Cy3抗体,羊抗兔IgG-FITC抗体)、避光洗涤、染核(DAPI)、避光洗涤、封片(抗荧光淬灭剂封片),在激光共聚焦显微镜下进行观察。结果表明,实验组中CT813显有红色荧光,CREB3显有绿色荧光,且二者间发生重叠,重叠部分为黄色荧光,提示CT813与内源性CREB3具有相互作用。综上,通过运用亚细胞定位技术与免疫共沉淀技术进一步确证了CT813的确可与CREB3发生作用。这为进一步探究沙眼衣原体CT813蛋白的生物学功能,从而为阐明沙眼衣原体的致病机制以及防治研究奠定基础。
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【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R440
【参考文献】
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