TLR4通过介导CX3CR1内吞促进脓毒症免疫崩溃的机制研究

发布时间：2017-03-17 18:05

  本文关键词：TLR4通过介导CX3CR1内吞促进脓毒症免疫崩溃的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:脓毒症是临床上亟待解决的难题,免疫崩溃是此类患者死亡的重要原因。阐明脓毒症免疫崩溃的机制有助于寻找新的临床策略以改善预后。文献报道,TLR4与脓毒症免疫反应密切相关,并且Toll样受体和趋化因子受体之间的交互作用,在机体免疫功能和炎症反应中发挥重要作用。本课题拟应用体内外脓毒症模型、“二次打击”动物模型、免疫耐受细胞模型,采用免疫共聚焦、q PCR等实验技术,以明确Toll样受体4(TLR4)以及其与趋化因子受体CX3CR1的交互作用在脓毒症免疫抑制期的作用以及机制。本课题的完成,有可能发现脓毒症的新机制,为临床治疗提供新的靶点。方法:分三部分:第一部分为探索CLP后免疫崩溃期以及“二次打击”模型后小鼠情况:(1)取25%结扎CLP模型,C57BL/6小鼠40只随机分成4组各10只,分别于0,1,4,7d眼球取血ELISA检测细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α,提取肺脏组织m RNA逆转录进行q PCR检测细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平,肺脏组织HE染色,肺脏研磨提取蛋白western blot检测P-NFκB P65。(2)采取盲肠结扎穿孔(CLP)后肺炎链球菌“二次打击”模型,结扎盲肠远端25%,取40只C57BL/6小鼠随机分为假手术组(n=10),CLP 1d后“二次打击”组(n=10),CLP 4d后“二次打击”组(n=10),CLP 7d后“二次打击”组(n=10),观察小鼠“二次打击”后7天生存率。第二部分为研究TLR4对脓毒症免疫崩溃作用并探索发挥作用的可能途径:(1)取野生型(WT)小鼠(即C57BL/6小鼠)10只,TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠10只,采取25%CLP 4d后肺炎链球菌“二次打击”模型,观察其“二次打击”后7天生存率。(2)采取25%结扎CLP模型,C57BL/6小鼠与TLR4-/-小鼠各40只随机分成4组各10只,分别于0,1,4,7d取腹腔巨噬细胞,共聚焦显微镜技术观察CX3CR1内吞情况。第三部分为研究CX3CR1内吞促进免疫崩溃的可能机制:使用细胞系RAW264.7细胞,si RNA干扰CX3CR1、氯丙嗪抑制网格蛋白、si RNA干扰β-arrestin,并构建免疫耐受细胞模型,于LPS二次处理后第3h分别收集上清液ELISA检测细胞因子IL-1β、IL-6、TP-NFα的浓度。结果:1.El ISA结果显示,C LP造模第4d小鼠血清IL-1β、TNFα、IL-6浓度较之CLP造模第1d、7d显著降低(P0.05);q PCR结果提示CLP造模第4d肺脏组织中IL-1β、TNFα、IL-6基因表达水平较之CLP造模第1d、7d降低(P0.05);病理切片HE染色结果提示CLP造模第1d小鼠肺脏组织炎症细胞浸润较明显,肺泡结构破坏严重,之后逐渐缓解;Western Blot结果提示CLP造模第1d小鼠肺脏组织P-NFκB P65蛋白表达水平最高,之后逐渐降低;CLP造模第4d鼻腔给予肺炎球菌悬液的脓毒症小鼠,生存率最低为40%,第1d、第7d给予肺炎球菌悬液小鼠生存率分别为60%、80%。2.较之野生型(WT)小鼠,TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠CLP造模第4d鼻腔给予肺炎球菌悬液的脓毒症小鼠,生存率明显增加;WT小鼠CLP造模后第4d取腹腔巨噬细胞免疫共聚焦显微镜下可见CX3CR1明显内吞,TLR4-/-小鼠腹腔巨噬细胞未见CX3CR1内吞。3.较之未处理RAW264.7细胞,si RNA干扰CX3CR1处理的RAW264.7细胞建立免疫耐受细胞模型后LPS二次处理3h的上清液细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α浓度显著增加(P0.05);较之未处理RAW264.7细胞,氯丙嗪处理的RAW264.7细胞建立免疫耐受细胞模型后LPS二次处理3h的上清液细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α浓度显著增加(P0.05);较之未处理RAW264.7细胞,si RNA干扰β-arrestin处理的RAW264.7细胞建立免疫耐受细胞模型后LPS二次处理3h的上清液细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α浓度显著增加(P0.05)。结论:1.小鼠脓毒症CLP模型后第4d为免疫崩溃期,并且免疫崩溃期二次感染的生存率低;2.TLR4基因敲除可增加免疫崩溃期二次感染生存率,可能原因是TLR4通过介导CX3CR1内吞途径促进免疫崩溃。3.TLR4通过诱导网格蛋白内吞途径实现CX3C R1内吞,并通过内吞组分β-arrestin促进免疫崩溃。
【关键词】：TLR4 CX3CR1 内吞 脓毒症 免疫崩溃
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 绪论12-16
• 材料和方法16-27
• 1 材料16-17
• 1.1 试剂16
• 1.2 实验耗材16-17
• 1.3 仪器17
• 2 方法17-27
• 2.1 研究对象17-18
• 2.2 实验分组18-19
• 2.3 小鼠CLP及“二次打击”模型制备[31]19
• 2.4 小鼠腹腔巨噬细胞分离和培养19-20
• 2.5 RAW264.7 细胞培养20-21
• 2.6 免疫耐受细胞模型21
• 2.7 石蜡切片HE染色21-22
• 2.8 Western Blot22-23
• 2.9 酶联免疫吸附试验23-24
• 2.10 细胞干扰24
• 2.11 细胞免疫共聚焦24-25
• 2.12 抽提细胞总RNA以及Real- Time PCR25
• 2.13 PCR引物序列25-26
• 2.14 统计学方法26-27
• 结果27-31
• 1 探索CLP后免疫崩溃期以及“二次打击”模型后小鼠情况27-28
• 2 研究TLR4对脓毒症免疫崩溃作用并探索发挥作用的可能途径28-29
• 3 研究CX3CR1内吞促进免疫崩溃的可能机制29-31
• 讨论31-33
• 结论33-34
• 参考文献34-38
• 综述38-48
• 参考文献44-48
• 致谢48-49
• 硕士期间发表文章49

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本文编号：253254