肠道细菌Akkermansia muciniphila核酸适配体的筛选

发布时间：2019-11-19 16:31

【摘要】：目的筛选能高效特异结合Akkermansia muciniphlia(A.muciniphlia)的核酸适配体,为后续利用适配子进行A.muciniphlia的检测和鉴定奠定基础。方法合成83bp随机ssDNA文库,运用指数富集配体系统进化技术,筛选A.muciniphlia的核酸适配体,并对其进行序列测定、结构分析、解离常数(KD值)测定及特异性验证。结果经8轮筛选后,随机ssDNA文库的亲和力从5.23上升56.99,筛选出的适配体富集库经克隆、测序后得到16条不同的核酸序列,根据同源性分成3个家族,最终筛选到2条对A.muciniphlia有较高亲和力的高频适配体,相应的KD值分别为34.8nmol/L和12.8nmol/L(P0.05)。结论本文首次筛选出了对A.muciniphlia具有较高亲和力和特异性的适配体,有望用于A.muciniphila的鉴定和检测。
【图文】：

坐标，Origin软件拟合解离曲线，，计算解离常数(KD值)。适配体的二级结构采用ＲNAstructure软件进行预测。1.7克隆适配体亲和特异性验证通过1.6解离常数的测定，选择解离常数孝亲和力强的适配体进行特异性验证。具体如下:每个适配体取10pmol，分别与1.0×108cfu的目标菌和反筛菌混合物(见表2)结合，测定相应的荧光强度。重复试验3次，比较二者的荧光强度是否存在差异。其中反筛菌混合物为7种反筛菌分开培养后，各取1mL混合离心，用H2O通过麦氏比浊法调整浓度后得到的菌悬液。2结果2.1PCＲ扩增的最优循环数由图1可见，第11～13个循环的扩增产物均为略小于100bp的单一条带，与随机ssDNA文库总长度为83bp的目的片段接近，因此符合预期结果。但是从第14个循环开始至第18个循环，产生的条带逐渐偏离目标片段83bp的位置，并出现多个略大于100bp条带的非特异性扩增条带，其扩增效果不理想。另外由于第13个循环的条带最亮，其PCＲ扩增产物量最多，因此该轮筛选后PCＲ扩增的最优循环数为13。研究显示，其他轮次筛选后PCＲ的最优循环数见表1，其扩增产物电泳结果与图1类似，不再逐一列出。表1SELEX过程中各轮筛选后PCＲ的最优循环数筛选轮数23456789101112最优循环数14131512152119181414132.2SELEX筛选过程中亲和力变化如表2、图2所示，随着SELEX筛选的进行，ssDNA富集库与A.muciniphlia的亲和力逐渐增加，第8轮时达到顶峰，与第3轮相比，亲和力提高了10.9倍(56.99/5.23)。第8轮之后，随着反筛压力的施加，ssDNA富集库与A.muciniphlia的亲和力不断降低，因此选择第8轮ssDNA富集库进行后续试验。图1第3轮筛选后优化PCＲ的琼脂糖凝胶电泳图注:图中11－18代表PCＲ扩增至第11个循环～第18个循环时所获得的产物电泳条带表2SE

脂糖凝胶电泳图注:图中11－18代表PCＲ扩增至第11个循环～第18个循环时所获得的产物电泳条带表2SELEX筛选过程中反筛情况及结合率测定结果轮数反筛菌F1F0结合率(%)3无2.234614.23905.235无2.124312.07065.876金黄色葡萄球菌－－－7蜡样芽孢杆菌1.11666.42555.798沙门菌18.833011.014656.999志贺菌27.830725.699136.1010大肠埃希菌12.797635.025912.1811水弧菌9.843035.10289.3512溶血性链球菌5.520926.35186.98注:F1为筛选后的荧光强度，F0为筛选前的荧光强度，结合率=(F1/3F0)%图2ssDNA文库与A.Muciniphila的亲和力变化·3210·现代预防医学2017年第44卷第17期ModernPreventiveMedicine，2017，Vol.44，NO.17

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本文编号：2563150