尿样中柠檬黄与已烯雌酚ELISA检测方法的建立和随机人群暴露水平分析

发布时间：2019-11-21 01:33

【摘要】：1、柠檬黄ELISA检测方法的建立和随机人群暴露水平分析随着物质生活水平的不断提高,食品安全问题引起了人们的高度重视。柠檬黄是一种使用广泛的食用色素,可使食品色泽艳丽,提升食物的感观品质。因为柠檬黄摄入后会大部分以原型的形式排出,所以在我国制定的食用色素标准限量范围之内使用柠檬黄是安全的。但是为了提升销量,一些商家会出现非法超量使用柠檬黄的情况,造成柠檬黄在人体内暴露增加,对人体造成不利影响。所以,我们需要对人体柠檬黄内暴露情况进行监测。本文通过制备柠檬黄的单克隆抗体,建立了高灵敏度的ELISA方法,对576个人体尿液样品进行了批量检测,收集柠檬黄在人体内暴露情况的数据并对内暴露情况进行分析。研究目的：研究随机人群样本中柠檬黄的内暴露水平。研究方法：采用弗式免疫佐剂免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术筛选特异识别柠檬黄的单克隆抗体。建立并优化灵敏度高的ELISA检测方法,并对ELISA方法进行方法学考察。利用建立的ELISA方法对576个人体尿液样本进行检测。研究结果：经细胞融合、筛选、纯化后的柠檬黄单克隆抗体浓度为2.72mg/mL,该抗体与食用色素日落黄、诱惑红、靛蓝、胭脂红、亮蓝、苋菜红均无交叉反应,特异性良好。所建立的ELISA方法LOD和IC50分别为0.31ng/mL和2.96ng/mL。板内变异系数为3.69%至4.89%,板间的变异系数为1.17%至4.54%,两者均小于20%,精密度良好。回收率为99.14%至108.40%,在80%至120%之间,准确性良好。与传统HPLC检测方法比较,显示相关性良好(R2=0.99,n=6),证明该ELISA方法检测尿样结果可靠。576个尿液样本中柠檬黄的检出率为100%,浓度为0.36ng/mL至38.31ng/mL,平均浓度为5.15ng/mL,几何平均值(GM)为3.70ng/mL。男性尿液样本中的柠檬黄含量平均值(5.36ng/mL)略高于女性(4.86ng/mL),但无显著性差异。50岁以下年龄组尿样中检测到的柠檬黄的含量显著高于50以上年龄组(P0.05)。其中,41-50岁年龄组尿液样本中的柠檬黄含量显著高于50-60岁年龄组(P0.05)。结论：建立的ELISA方法可用于人体尿液样本的检测,收集了柠檬黄在随机人群样本中的内暴露数据,得到柠檬黄在随机人群中的暴露特点。2、已烯雌酚ELISA检测方法的建立和随机人群暴露水平分析在生活水平提高的同时,肉制品及鱼虾类水产品的需求日益增多,促进了养殖业的快速发展。为了提高牲畜及鱼虾等产品的产量,缩短生长周期,养殖人员或饲料生产厂家会向饲料中非法添加生长激素,如己烯雌酚,达到提高收益的目的,从而通过食物链造成水和土壤中己烯雌酚的污染及人体己烯雌酚内暴露。作为一种雌激素,孕期妇女暴露于已烯雌酚中会增加后代的癌症风险,并会影响少年儿童的正常生长发育。所以我们通过制备已烯雌酚的单克隆抗体,建立了高灵敏度检测已烯雌酚的ELISA方法,对已烯雌酚人体内暴露情况进行监测。并通过576个样品的批量检测,收集已烯雌酚在人体内暴露情况的数据并进行内暴露分析。研究目的：研究随机人群样本中已烯雌酚的内暴露水平。研究方法：采用弗式免疫佐剂和快速免疫佐剂分别免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术筛选特异识别已烯雌酚的单克隆抗体。建立并优化灵敏度高的ELISA检测方法,并对ELISA方法进行方法学考察。利用建立的ELISA方法对576个人体尿液样本进行检测。研究结果：经细胞融合、筛选、纯化后的已烯雌酚单克隆抗体浓度为8.32mg/mL该抗体与两种雌激素雌酮和雌二醇以及两种结构类似物双酚A及沙丁胺醇均无交叉反应,特异性良好。所建立的ELISA方法LOD和ICs0分别为0.29ng/mL和3.33ng/mL。板内变异系数为8.79%至15.74%,板间的变异系数为3.25%至10.23%,两者均小于20%,精密度良好。回收率为91.20%至118.07%,在80%至120%之间,准确度良好。与传统HPLC检测方法比较,显示相关性良好(R2=0.99,n=6),证明该ELISA方法检测尿样结果可靠。576个尿液样本中已烯雌酚的检出率为98.78%,浓度为LOD至42.85ng/mL,平均浓度为4.70ng/mL,几何平均值(GM)为3.50ng/mL。男性中已烯雌酚的平均值为5.07ng/mL,高于女性(P0.05)。年龄41-50岁的人群平均值最高,为5.60ng/mL。超过50岁的人群有相对较低的已烯雌酚含量。结论：建立的ELISA方法可用于人体尿液样本的检测,收集了已烯雌酚在随机人群样本中的内暴露数据,得到已烯雌酚在随机人群中的暴露特点。
【图文】：

小鼠血清,小鼠,免疫佐剂,血清效价

逡逑１０巧ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠通过弗式免疫佐剂背部多点注射免疫３次后，通过小鼠暇逡逑眶取血检测了血清效价。由图２．１可看出，在血清稀释５００倍时，３、４、５、６号小逡逑鼠的ＯＤ值较高，但当稀释至４０００倍时，４号和６号小鼠ＯＤ值出现了明显的降逡逑低。由图２．２可看出，，５至１０号小鼠在ＯＤ值为１．０时的抑制率均可这到８０％Ｗ逡逑上。综合考虑抗体效价与灵敏度，我们选择５号小鼠进行细胞融合。逡逑Ｍ１／５００逡逑１２３４５６７８９逦１０逡逑Ｔｈｅ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ逡逑图２．１邋１０只梓模黄免疫小鼠血清稀释５００倍和４０００倍时的ＯＤ值逡逑Ｆｉｇ邋２．１邋ＯＤ邋ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ｔｅｎ邋ｉｍｍｕｚｅｄ邋ｍｉｃｅ邋０打邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｅｒｕｍ邋ｄｉｌｕｔｉｏｎ逡逑１８逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R446.12

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