MicroRNA-146a调控缩窄性心包炎心肌纤维化的分子机制及超声影像学研究

发布时间：2020-03-19 08:52

【摘要】：目的:缩窄性心包炎(Constrictive Pericarditis,CP)是指多种原因所致的心包纤维性增厚、钙化,使心脏舒张期充盈受限,静脉回流受阻而引起的一系列综合征。CP病程长者可使心肌发生废用性萎缩、心肌纤维化(Myocardial Fibrosis,MF),最终可发展成心力衰竭。Sengupta等研究发现CP患者心脏圆周形变能力减低、扭转和解旋能力下降;同样,我们利用二维斑点追踪显像(Speckle-tracking Imaging,STI)技术对CP患者左室心肌旋转功能观察,发现患者心尖水平心外膜下心肌旋转角度及整体旋转角度较正常人明显减低,这种收缩功能减低在一定程度上跟心肌的纤维化有关。但CP患者心肌纤维化的规律及机制尚不明确,心肌成纤维细胞(Cardiac Fibroblasts,CFs)的细胞间通讯在缩窄性心包炎心肌纤维化发病机制中起着重要作用,有研究报道多种microRNAs(miRNAs)与心肌成纤维细胞存活和相关的信号传导通路有关。本研究旨在探讨心肌纤维化心肌中miRNAs的表达及其调控靶基因活化情况,更好地了解CP心肌纤维化分子机制及发现新的早期干预靶点。研究方法:1.制备Wistar大鼠缩窄性心包炎模型,从大体及病理切片观察动物模型是否建立成功,造模成功后,收集心肌组织,应用高通量测序技术分析心肌纤维化心肌中miRNAs的表达情况。2.制备Wistar大鼠缩窄性心包炎不同病程模型,30只大鼠随机分为三组:模型16W组(CP16W),模型8W组(CP8W),对照组(N),每组10只。检测MicroRNA-146a(miR-146a)的表达随病程的变化;应用STI评价大鼠左心室心肌功能的变化,评价心肌功能改变与心肌纤维化的相关性。3.应用CP大鼠模型心脏标本,实时定量聚合酶链反应(Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测缩窄性心包炎大鼠心肌中miR-146a靶基因Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)的下游基因白细胞介素1受体相关激酶1(IL-1 receptor-associated kinase 1,IRKI1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor-6,TRAF6)的mRNA表达水平。蛋白印迹试验(Western-blot法)检测TRL4信号转导通路中IRAK1、TRAF6、核转录因子κB(Nuclear Factor-kappa B,NF-κB)及磷酸化核因子-κB(Phosphate Nuclear Factor-kappa B,p-NF-κB)蛋白表达水平变化。4.原代培养大鼠心肌成纤维细胞,转染miR-146a,应用LPS处理,RT-PCR和Western Blot检测下游效应物的表达情况,验证miRNA-146a通过TLR4信号通路调控心肌成纤维细胞功能。结果:1.在成功构建缩窄性心包炎大鼠模型的基础上,利用高通量测序法对CP模型组和对照组各3例样本进行miRNA分析,筛选出组间差异miRNAs共34个,其中CP模型组表达上调miRNAs 17个,表达下调miRNAs 17个。MiR-146a具有最显著的表达丰度。组织样本进行RT-PCR检测结果显示:CP8W组miR-146a表达较对照组增高,CP16W组与对照组相比无统计学差异,与CP8W组相比则减低,miR-146a随病程发生动态变化。2.超声评价心肌纤维化:与N组相比,CP8W组左室游离壁外层及中层心肌圆周应变(Circumferential Strain,SC)减低,CP16W组左室游离壁外层、中层及内层心肌SC均减低。与CP8W组相比,CP16W组左室游离壁中层及外层心肌SC进一步减低。CP8W组与CP16W组的纵向应变(Longitudinal Strain,SL)变化趋势与SC一致。与N组相比,CP8W组径向应变(Radial Strain,SR)无明显变化,CP16W组左室整体及游离壁SR减低。心肌组织苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE染色)、Masson染色及天狼星红染色(Sirius red Staining,SR染色)见心包增厚及心肌纤维化。CP8W组大鼠模型心肌纤维化主要位于左室游离壁心外膜下心肌,CP16W组大鼠模型位于左室游离壁心肌各层。各组大鼠心肌组织纤维化指标α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(Type I collagen,COLⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(TypeⅢcollagen,COLⅢ)mRNA表达较对照组增高,CP16W模型组α-SMA及COLⅠmRNA较CP8W模型组进一步增高。3.MiR-146a靶基因IRAK1、TRAF6在缩窄性心包炎大鼠模型心肌组织中的表达情况。RT-PCR及WB的结果显示:CP8W组IRAK1和TRAF6较对照组减低,CP16W组与对照组无统计学差异,与CP8W组相比则升高。4.与control组相比,LPS处理组IRAK1、TRAF6、p-NF-κB及α-SMA表达均增高;转染miR146a模拟物后,与LPS组比较,IRAK1、TRAF6、p-NF-κB及α-SMA表达均减低;转染miR-146a抑制物后,与LPS组比较,IRAK1、TRAF6、p-NF-κB及α-SMA表达均增高。结论:1.本研究应用经胸心包注射LPS及TP混合致炎溶液的方法成功制备了缩窄性心包炎大鼠模型。2.应用高通量测序技术分析共筛选出组间差异miRNAs 34个,其中CP模型组miR-146a具有最显著的表达丰度。3.在CP心肌纤维化不同病程模型中,miR-146a的表达表现为先增高后降低的动态变化。应用STI技术可以从纵向、径向及圆周三个方面对CP心肌纤维化进行准确评估,动态观察心肌纤维化是从外层心肌向内层心肌逐渐进展的过程。4.大体及细胞研究结果证实,miR-146a表达上调具有抑制CP大鼠心肌纤维化的作用,miR-146a通过作用Toll样受体4信号通路中的靶基因TRAF6和IRAK1来实现调控心肌纤维化。
【图文】：

中国医科大学博士学位论文厚、蓝染，阳性染色面积比显著高于 N 组，心外膜下心肌组织间隙内局部可见蓝染(见图 1.1C、G、J 及表 1.2)；SR 染色：光镜观察Ⅰ、Ⅲ型胶原呈红色、肌纤维呈淡黄色，细胞核呈蓝色。N 组大鼠脏层心包呈单层、红染；CP 组脏层心包明显增厚、红染，，阳性染色面积比显著高于 N 组，心外膜下心肌组织间隙内局部可见红染。（见图 1.1D、H、K 及表 1.2）

中国医科大学博士学位论文表 1.2 CP 大鼠模型心包厚度及阳性染色面积比比较（ x±S）分组 n脏层心包厚度(μm)MS 阳性染色面积比(%)SR 阳性染色面积(%)N 3 10.66 ±3.00 9.88 ±3.44 7.32 ±1.60CP 3 261.90 ±103.52 30.90 ±10.00 25.97 ±8.70t -4.203 -3.44 -3.65P 0.014* 0.026* 0.022*3.1.2 RT-PCR 及 Western Blot 验证对 CP 模型组与对照组大鼠心肌组织中 α-SMA 的 mRNA 进行 RT-PCR 检测对 α-SMA 蛋白表达进行 western blot 检测。与对照组相比，CP 模型组 α-SMA mRNA 及蛋白表达增高。见图 1.2
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R445.1;R542.11

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本文编号：2590007