滚环扩增检测miR-93-5p的方法学研究

发布时间：2020-03-20 01:29

【摘要】：目的:本研究旨在发展一种利用滚环扩增技术直接检测miR-93-5p快速简便的方法,同时与RT-qPCR方法检测miR-93-5p的结果进行比较,考察两种方法的检测灵敏度和检测特异性的差异。为了得到预期的检测结果,分别考察了环形模板的二级结构等不同因素,以miR-93-5p的检测为例,探讨不同二级结构的锁式探针对滚环扩增的影响,同时筛选出一条最优的锁式探针链用于检测miR-93-5p。研究方法:1、RNA structure软件预测不同二级结构的锁式探针。2、细胞培养。3、利用RCA方法检测细胞中的miR-93-5p。4、利用RT-qPCR方法检测细胞中的miR-93-5p。5、琼脂糖凝胶电泳。6、聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果:1、本研究所用最优锁式探针是无二级结构的锁式探针1。2、锁式探针和连接序列的最优环化连接终浓度为500 nmol/L。3、环化连接最优时间为4 h。4、环化产物最优酶切时间为9 h。5、RCA检测miR-93-5p的灵敏度范围为1 pM~10~4 pM。6、PCR检测miR-93-5p的灵敏度范围为10 pM~10~4 pM。7、RCA和PCR方法检测miR-93-5p均具有良好的特异性。8、RCA和PCR方法均可从实际样品中检出miR-93-5p,两种方法均适用于实际检测。结论:1、建立了一种基于滚环扩增的恒温检测平台,开发了一种快捷、简便、灵敏、特异、半定量、经济有效的检测miR-93-5p的新技术。2、我们用RCA和PCR两种方法检测miR-93-5p,系统的比较了RCA方法和PCR方法检测miR-93-5p的灵敏度和特异性。其中,RCA方法的检测范围是1 pM~10~4pM,PCR方法的检测范围是10 pM~10~4 pM,RCA方法较PCR方法的检测灵敏度相近。RCA和PCR方法的特异性均良好,可特异的检测出miR-93-5p。
【图文】：

在激发光的激发作用下产生强荧光，，通过酶标仪收集荧光信号的变化，从而达到检测miR-93-5p 的目的。反应原理如图1 所示。图1. 滚环扩增检测 miR-93-5p 原理图

预测的锁式探针2的二级结构图
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R440

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本文编号：2591026