周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩和屏障功能的协同保护作用及机制

发布时间：2020-03-20 20:14

【摘要】：脓毒症是ICU中常见的危重病症,其发生率和死亡率均很高。据统计,我国每年有300万脓毒症患者,约100万人死于脓毒症。脓毒症和脓毒性休克的后期会出现血管功能障碍,即血管低反应性和血管渗漏,最终导致多器官功能衰竭,ICU中30%-40%的病人死亡与血管低反应性和血管渗漏有关。针对脓毒症血管低反应性和血管渗漏的发生机制,提出了一系列的治疗措施,但这些措施在纠正血管低反应性和血管渗漏过程中存在矛盾现象,如用缩血管药物增加血管反应性的同时,会导致血管内皮细胞骨架蛋白收缩,加重血管渗漏。目前临床上缺乏协同治疗血管低反应性和血管渗漏的措施。周细胞(Pericyte,PC)是位于小血管、微血管和毛细血管内皮细胞周围、基底膜内的一群具有收缩、分泌和多项分化潜能的细胞。近年来研究发现,周细胞参与炎症、免疫紊乱、血管异常增生等病理生理过程,在多种疾病如癫痫、阿尔兹海默症、糖尿病、心肌缺血、肺纤维化的发生发展过程中发挥重要作用。而周细胞能否协同调控和保护脓毒症后血管舒缩和屏障功能,及其主要作用机制是什么,目前尚不清楚。据此,本研究利用盲肠结扎穿孔(Cecal Ligation and Puncture,CLP)及静脉注射LPS复制SD大鼠和转基因小鼠脓毒症模型,以及LPS刺激血管平滑肌细胞(VSMC)和血管内皮细胞(VEC),分别从整体及离体水平研究了周细胞对脓毒症血管反应性和血管通透性的协同保护作用及机制。研究内容:第一部分脓毒症周细胞结构和功能的变化及与血管反应性和血管通透性的关系利用CLP及静脉注射LPS复制脓毒症大鼠及小鼠(周细胞荧光标记)模型,观察脓毒症后不同时相点(6h、12h、24h)肠系膜血管周细胞数量和结构的变化;观察肠系膜血管舒缩反应性和血管通透性的变化,及其相关调节蛋白表达的变化,分析脓毒症后周细胞结构和功能的变化与血管反应性和血管通透性间的关系。第二部分输注外源性周细胞对脓毒症大鼠血管低反应性和血管渗漏的协同保护作用利用脓毒症大鼠模型,输注外源性周细胞和功能增强的周细胞(poly(i:C)预刺激),观察周细胞在肠系膜微静脉上的定植情况,以及输注周细胞后对脓毒症大鼠肠系膜血管舒缩反应性、血管通透性及存活率的影响,以明确周细胞对脓毒症大鼠血管舒缩功能和屏障功能的协同保护作用。第三部分周细胞敲减大鼠血管反应性和血管通透性的变化及输注外源性周细胞对血管舒缩功能和屏障功能的回复作用用CP-673451(PDGFR-β抑制剂)建立周细胞敲减大鼠模型(药物敲减模型),观察周细胞敲减大鼠在脓毒症后血管反应性和血管通透性的变化情况,以及输注外源性周细胞对血管反应性和血管通透性的回复作用,以进一步明确周细胞对脓毒症大鼠血管反应性和血管通透性的协同保护作用。第四部分周细胞协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制1.周细胞调节血管平滑肌细胞舒缩功能和血管内皮细胞屏障功能的直接作用利用培养的VSMC和VEC,观察正常和LPS刺激下周细胞与VSMC和VEC间直接接触的情况,以及对VSMC舒缩功能和VEC屏障功能的直接调节作用。2.周细胞微囊泡(PCMV)协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制利用培养的周细胞:(1)观察周细胞和功能增强周细胞分泌微囊泡数量的变化;(2)观察PCMV在VSMC和VEC中的吸收情况;(3)观察PCMV对整体动物和离体细胞血管反应性和血管通透性的影响;(4)观察PCMV及Poly(i:C)PCMV所含生长因子、microRNA的数量、种类的变化,观察这些活性物质对VSMC收缩功能和VEC屏障功能的影响。主要研究结果:第一部分脓毒症周细胞结构和功能的变化及与血管反应性和血管通透性的关系1.大鼠CLP和LPS致脓毒症后,肠系膜微血管周细胞数量明显减少、脱落;肠系膜微动脉舒缩反应性降低、血流速度逐渐减慢、肠系膜上动脉p-MLC_(20)表达降低,肠系膜微静脉血管通透性增加、血管内皮细胞明显肿胀、内皮连续性结构破坏、紧密连接明显开放同时伴有红细胞渗出、肠系膜上静脉ZO-1和VE-cadherin表达降低。结果提示脓毒症后周细胞的脱落与血管低反应性和血管渗漏密切相关。2.周细胞荧光标记的小鼠脓毒症后,肠系膜微静脉及毛细血管PDGFR-β荧光表达降低,微血管周细胞脱落;肠系膜微动脉舒缩反应性降低,血管渗漏增加、血管内皮细胞明显肿胀、血管内皮结构破坏。上述结果进一步证实脓毒症后周细胞的脱落与血管低反应性和血管渗漏密切相关。第二部分输注外源性周细胞对脓毒症大鼠血管低反应性和血管渗漏的协同保护作用输注周细胞可定植于肠系膜微静脉上,在输注后24h定植最多。周细胞输注后可明显提升脓毒症大鼠72h的存活率和存活时间,明显改善脓毒症大鼠血管反应性、血管流速及肠系膜上动脉p-MLC_(20)的表达;改善肠系膜血管屏障功能、改善血管内皮细胞结构和增加连接蛋白表达,功能增强(Poly(i:c)预处理)的周细胞效果更好。提示外源性周细胞对脓毒症血管反应性和血管通透性具有协同保护作用。第三部分周细胞敲减大鼠血管反应性和血管通透性的变化及输注外源性周细胞对血管舒缩功能和屏障功能的回复作用周细胞敲减大鼠肠系膜微血管周细胞数量减少、覆盖率明显降低,血管舒缩反应性明显降低,血管通透性明显增加、血管内皮紧密连接明显开放、血管内皮连接蛋白表达明显降低,周细胞输注后可恢复周细胞减少导致的血管舒缩功能和屏障功能的破坏。脓毒症会加重周细胞敲减大鼠的血管低反应性和血管渗漏,输注外源性周细胞可明显改善周细胞敲减大鼠脓毒症后血管反应性、血流速度和肠系膜上动脉p-MLC_(20)表达,改善血管通透性,增加连接蛋白的表达;功能增强(Poly(i:c)预处理)的周细胞效果更好。提示输注外源性周细胞对周细胞敲减大鼠的血管反应性和血管通透性具有回复作用。第四部分周细胞协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制1.周细胞调节血管平滑肌细胞舒缩功能和血管内皮细胞屏障功能的直接作用周细胞与VSMC和VEC可直接接触形成连接,直接调节VSMC的收缩功能和VEC的屏障功能。2.周细胞微囊泡协同调节血管反应性和血管通透性的作用及机制周细胞可通过产生微囊泡(PCMV)协同改善VSMC舒缩功能和VEC屏障功能。机制研究发现,PCMV可通过携带Ang-1、miR-145和miR-132来发挥对VSMC收缩功能和VEC屏障功能的协同保护作用。miR-145主要作用于VSMC,抑制Sphk2和S1PR1表达,增加S1PR2和p-MLC_(20)的表达,改善血管平滑肌细胞舒缩功能;miR-132主要作用于VEC,抑制Sphk2和S1PR2的表达,增加S1PR1、ZO-1和VE-cadherin的表达,改善血管内皮细胞屏障功能。提示周细胞主要通过分泌微囊泡携带Ang-1、miR-145和miR-132作用于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,实现对脓毒症血管反应性和血管通透性的协同调控和保护作用。结论:1.脓毒症后肠系膜微血管周细胞结构破坏、数量减少、覆盖率降低,在血管低反应性和血管渗漏中发挥重要作用。2.输注外源性周细胞可协同改善脓毒症血管低反应性和血管渗漏。3.周细胞敲减大鼠肠系膜微动脉收缩和舒张反应性明显下降,血管通透性明显增加,输注周细胞后可明显恢复周细胞减少导致的血管舒缩功能和内皮屏障功能损伤。4.周细胞可通过直接接触和分泌微囊泡协同保护脓毒症血管反应性和血管通透性。直接作用主要是周细胞与VSMC和VEC直接接触形成紧密和缝隙连接,产生物理覆盖和调节作用。旁分泌作用主要是周细胞分泌内含多种活性物质的微囊泡来发挥作用,如Ang-1、miR-145和miR-132。一方面周细胞分泌携带Ang-1的微囊泡,传递至VSMC和VEC,增加血管平滑肌细胞舒缩功能和血管内皮细胞屏障功能。另一方面,周细胞通过分泌携带miR-145和miR-132的微囊泡来发挥协同保护作用,其中miR-145主要在血管平滑肌细胞中起作用,它主要是通过降低Sphk2和S1PR1的表达,增加S1PR2和p-MLC_(20)的表达来发挥作用;miR-132主要在血管内皮细胞中起作用,它主要是通过降低Sphk2和S1PR2的表达,增加S1PR1、ZO-1和VE-cadherin的表达来发挥作用。
【图文】：

酸化水平的变化与假手术组相比，脓毒症后不同时相点大鼠肠系膜微动脉收缩和舒张反应性逐渐降低（图2A），表现为脓毒症24h后肠系膜微动脉对NE和Ach的反应性分别由正常的100%和 98.9%降低至 30.3%和 38.9%；肠系膜微动脉和微静脉的红细胞流速也逐渐减慢，与假手术组相比，脓毒症 24h 肠系膜微动脉和微静脉的红细胞流速分别降低了 77.8%和

脓毒症大鼠肠系膜微静脉及毛细血管网通透性增加，，具体表现为肠系膜微静脉和毛细血管网对FITC-BSA的透过率逐渐增加，其中脓毒症后24h肠系膜微静脉的渗出从正常的16.6%增加至101.3%（图3A）；Western blotting结果显示，在CLP和LPS制备的脓毒症模型中，肠系膜上静脉血管内皮紧密连接（ZO-1）和粘附连接（VE-cadherin）蛋白的表达均逐渐降低，CLP组术后24h，肠系膜上静脉ZO-1和VE-cadherin的表达在模型后24h分别降低了63.1%和64.9%；LPS组术后24h，肠系膜上静脉ZO-1和VE-cadherin的表达在模型后24h分别降低了57.6%和63.1%（图3B）。免疫荧光结果显示，脓毒症24h后，肠系膜微静脉内皮间ZO-1和VE-cadherin的连续性破坏、表达降低（图3C）。内皮超微结果显示
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R459.7


本文编号：2592136