不孕患者泌尿生殖道微生物分布特征研究

发布时间：2020-03-21 11:35

【摘要】：目的:全球每年的育龄夫妇中约15%~20%会出现不孕不育,而其中由于生殖道感染导致不孕的患者达到20%-60%。导致不孕症发生的主要病原体为解脲支原体(Ureaplasma urealyticum,UU)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)和淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG),其中沙眼衣原体和解脲支原体导致的泌尿生殖道感染率呈增加趋势。此外,研究发现抗精子抗体(Antisperm antibody,A s A b)也是影响不孕的因素之一。本次研究通过对患者以及健康人群血液、阴道分泌物进行检测分析,探讨泌尿生殖道微生物分布特征,为不孕不育的诊断提供更科学的依据。方法:1.研究对象选取2017年1月-2018年1月于河北北方学院附属第一医院确诊的不孕症且无其他基础疾病的女性患者50名,年龄22~35岁,平均(27.45±2.54)岁。对照组选择在本院就诊的有正常生育能力的体检者50名。年龄22~37岁,平均(28.65±2.94)岁。2.入选标准结婚两年以上、未采取避孕措施,无滴虫性阴道炎、霉菌性阴道炎及细菌性阴道病等,排除遗传因素、解剖因素、内分泌因素、免疫功能异常,有生育要求。3.荧光定量PCR:选取2017年1月-2018年1月于河北北方学院附属第一医院确诊的不孕症且无其他基础疾病的女性患者50名,并选择同期在本院检查的育龄期健康对照组50名。采集患者阴道分泌物于无菌管,向无菌管中加入1ml灭菌生理盐水,充分震荡摇匀,挤干棉拭子,转移全部液体至1.5ml离心管中,离心12000rpm 5min,弃上清。沉淀中加入50μl DNA提取液,震荡5~10s,100℃金属浴10±1min,离心12000rpm/5min。取适量离心后的待测样本上清,点样至8连管中,盖上盖子,快速离心数秒,上机。PCR扩增条件:93 2min℃,℃93 45s→℃55 60s 10个循环,℃93 30s→℃55 45s 30个循环。自动读取实时荧光定量PCR仪的UU和CT定量值。酶联免疫吸附试验(ELISA):受试者均在清晨空腹状态下抽取静脉血3~5 ml,而且不做任何抗凝方面的处理,经5 min 3000转离心处理后将血清分离出来,保存于-20℃环境下,在检测前将血清解冻,静置在室温下,直至温度平衡。经由ELISA法进行测定。检测操作方法及判断结果方法严格按照分析仪及试剂盒说明进行。其中,每组抗体检测均设定阴性结果对照组及阳性结果对照组,以波长450nm照射下微孔板孔吸光度值为标准,高于标准值或阴性检测结果是标准值的2.1倍,可判断本次检测结果为阳性。测定患者血液中抗精子抗体(A s A b)及抗核抗体(Antinuclear antibody,ANA)含量。lon PGM?测序系统测序:采集患者以及健康育龄期对照人员阴道分泌物,提取阴道分泌物中DNA。取适量样品与离心管中,使用无菌水将样品稀释为1ng/μl。进行PCR扩增,检测以及纯化。纯化后将样品混合。构建文库,对样品进行测序分析。4.检测结果的统计学分析采用SPSS21.0对数据进行分析。计数资料以例和百分比表示,组与组间率的比较用卡方检验,以P0.05表明有统计学意义。数据间相关性采用pearson相关进行分析,其中pearson值0代表正相关性,pearson值0代表负相关性。P0.05表示相关性显著。结果:1 Lon PGM?测序结果沙眼衣原体文库稀释20倍后片段大小为370bp,浓度为253.40pg/μl。解脲支原体文库稀释50倍后片段大小为429bp,浓度为97.9pg/μl。沙眼衣原体mate-pair文库片段大小为299bp,浓度为48.57pg/μl。解脲支原体mate-pair文库片段大小为299bp,浓度为28.10pg/μl。菌株测序沙眼衣原体产生993Mbp的数据量,共4737434条reads,平均片段长度为210bp。解脲支原体产生642Mbp的数据量,共3461853条reads,平均片段长度为186bp。将全基因组与沙眼衣原体与解脲支原体的基因进行对比,结果与之相符。2 Real-time PCR结果1)不孕组50例患者中UU阳性例数为19例,阳性率为38%,CT阳性例数为17例,阳性率为34%。检测正常对照组50例,其中UU的阳性例数为5例,阳性率为10%,CT的阳性例数为4例,阳性率为8%。对两组UU和CT阳性率进行统计分析,均为P0.005,差异具有统计学意义,不孕组UU、CT阳性检出率显著高于对照组2)不孕组UU、CT阳性定量后结果为5.78±1.01,对照组为3.01±1.13(P0.05),两组定量数据均值差异显著性具有统计学意义,不孕组UU定量数据显著高于对照组。CT定量数据结果与分析,不孕组CT阳性为5.39±0.93,对照组为2.76±0.69,t=1.25,P0.05,两组数据的差异有统计学意义。3)UU,CT与不孕发生之间的相关系数分别为:0.251,0.604(P0.05)。UU和CT与不孕症发生之间具有相关性。3血清中抗核抗体、抗精子抗体检测结果1)不孕组抗核抗体、抗精子抗体的阳性率分别为40%、44%,正常对照组的阳性率分别为6%、8%,对照组与不孕患者之间存在有明显差异(P0.01)。不孕患者血样中的两种抗体含量明显高于正常对照组。2)血液中抗体表达量,在不孕患者血清中抗核抗体、抗精子抗体的含量分别为2.36±0.23、2.89±0.34。在对照组血清中的含量分别为1.08±0.35、1.35±0.19。不孕组抗体血清含量高于对照组含量(P0.05)。3)抗核抗体,抗精子抗体与不孕症发生之间的相关系数分别为:0.451、0.701,不孕的发生与患者血清中抗核抗体、抗精子抗体具有相关性(P0.05)。结论:1.阴道感染沙眼衣原体与解脲支原体可能是引起不孕症的原因;2.机体自身免疫因素,如抗核抗体、抗精子抗体的表达也是引起不孕发生的因素;3.阴道感染与自身免疫因素共同作用增加不孕症发生的几率;4.阴道感染以及免疫因素的排查同时进行可更准确判断不孕的发生。
【图文】：

步骤,基因组

基因组DNA提取步骤Fig.1GenomicDNAextractionstep

工作流程图,文库构建,基因组,工作流程

LonTorrent文库构建工作流程
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R711.6;R446.5

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