基于新型信号产生体系的高性能ELISA的构建及其应用

发布时间：2020-03-22 15:05

【摘要】：随着人口老龄化进程的加剧,癌症已经成为威胁人类健康的“头号杀手”。灵敏可靠的检测手段是实现肿瘤等重大疾病早期诊断,把握最佳治疗时机,提高治愈率的神兵利器。近年来,随着生物医学技术和纳米技术的迅猛发展,各种新兴的分析技术不断涌现。免疫分析技术凭借其操作简单,对分析仪器要求不高且费用低廉等优势,已经广泛应用于疾病标志物分析检测。本论文基于生物酶和纳米材料来构建性能良好的高分辨和双信号的检测方法,致力于提高免疫分析的灵敏度,同时通过多指标特征值定量检测目标物,提高分析体系的可靠性和准确性。本论文的主要研究内容及结果如下:1、脲酶介导的高分辨比色免疫分析方法的构建及性能研究传统的比色免疫分析方法通常是基于单一的从浅到深或从深到浅的颜色变化,当检测目标物浓度相近时,显色结果很难用肉眼区分,裸视的分辨率低。为解决这一难点,我们提出通过脲酶催化尿素水解致使溶液的pH升高并引起酸碱指示剂的颜色变化,进而实现目标物浓度依赖的多色高分辨信号的产生。实验中酸碱指示剂苯酚红作为显色剂,Ag~+作为脲酶抑制剂,我们通过碱性磷酸酶(ALP)催化抗坏血酸酯(AAO)的水解产生抗坏血酸(AA),进而引起Ag~+的还原并解除对脲酶的抑制作用;脲酶催化尿素水解产生的氨使指示剂苯酚红在pH 6.6~8.0范围内由黄色变为橙色再变为红色,实现了裸眼的定性和半定量检测,同时可以通过紫外可见分光光度计或手机拍照实现定量检测分析。本系统以兔免疫球蛋白(R IgG)为模型分析物,通过“三明治”夹心法将ALP修饰的特异性识别抗体引入检测体系,再通过上述显色体系实现定性或定量检测。具体地:当R IgG的浓度增加时,ALP将催化产生的更多的AA来还原Ag~+,生成的银单质失去了抑制脲酶活性的功能,使脲酶催化尿素产生更多的氨气,引起溶液pH升高和颜色由黄色向橙色和红色转变。通过模拟临床样本我们实现了在人血清中检测R IgG,验证了该方法在实际应用中的潜力。结果显示即使在10%的人血清中存在许多干扰分子,但该实验仍可以有效地识别和捕获R IgG,实现高选择性和特异性目标物检测。在最佳条件下,R IgG的线性检测范围为0-18ng mL~(-1),最低检测限为1.73 ng mL~(-1)。该比色结果直接使用智能手机获取图片,然后使用软件Image J进行定量分析,避免了昂贵而笨重的桌面设备的使用。2、基于铁基金属有机框架材料(Fe-MOFs)的双信号免疫分析方法构建及机理研究本实验采用溶剂热法制备了具有发光特性和类氧化酶活性的Fe-MOFs,其中有机配体为2-氨基对苯二甲酸(BDC-NH_2)。我们利用Fe-MOFs的固有特性构建了一种基于AA诱导发光增强和颜色抑制的新型双信号(发光和比色)免疫分析方法。本实验中,Fe-MOFs作为响应型荧光探针和催化TMB氧化显色的类酶,为检测体系提供荧光和比色两种检测信号。双信号的变化很容易通过控制AA的浓度进行调节,而AA的含量又通过免疫反应引入的ALP进行催化调节。基于上述原则,首先我们使用Fe-MOFs作为荧光探针检测AA,实现了最低检测限为0.051μM的超灵敏检测。我们进一步将上述信号产生策略与酶联免疫分析相结合,实现了人前列腺癌特异抗原(PSA)的高灵敏和高特异性检测。当系统中存在PSA时,ALP标记的抗体通过抗原抗体的特异性结合引入到酶标板上,随之催化AAO产生AA并诱导Fe-MOFs呈现荧光增强的现象,同时AA也将抑制Fe-MOFs催化TMB生成蓝色的oxTMB,最终产生的荧光和比色双信号通过全波长酶标仪进行定量测试。在人血清中检测PSA,检测限为180 pg mL~(-1),远远低于正常人血液中PSA的含量,具有在实际检测中的应用价值。本工作首次提出了AA诱导Fe-MOFs发光增强现象,并通过一系列实验解释了其作用机制。与游离的有机配体(BDC-NH_2)相比,由于配体与金属离子间的电荷转移(LMCT)和吸收猝灭作用,材料的发光性能明显较弱。当Fe-MOFs遇AA后,由于铁离子的价态变化和LMCT的部分中断致使BDC-NH_2荧光恢复,实现荧光从弱到强。当与AA反应后,LMCT的UV-vis吸收峰消失以及Fe-MOFs的Fe 2p结合能降低,进一步证实了之前的推测。综上所述,本课题基于脲酶和Fe-MOFs开发了两种应用于肿瘤标志物检测的新型高分辨比色和多信号免疫分析法,在模拟生物医学样本的检测中,实现了高灵敏度、高特异性的检测结果。另外,上述基于酶联免疫开发的检测方法同样适用于其他生物大分子或小分子的检测。该类新型可视化免疫分析方法不仅具有良好的商业应用前景,同时为生物检测领域的发展提供了新的解决思路。
【图文】：

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高亲和力和高特异性保证了免疫分析的高选择性和高的灵敏度。免疫分析具有独特的优势，如检测速度快、灵敏度高、特异性强、易用性高，在不同的科学领域已被广泛应用，同时展示了越来越广阔的应用前景。根据免疫分析信号的类型，免疫分析可分为电化学免疫分析、压电免疫分析、磁学免疫分析和光学免疫分析。1.1.1 电化学免疫分析电化学免疫分析法是目前手持式免疫化学检测中一种很有前途的方法。电化学免疫分析的原理如图 1-1 所示[2]，它利用固定的识别探针选择性地结合目标物或分析物分子，溶液中探针捕获目标物，并通过检测表面上局部的电信号变化来达到检测的目的。基于电化学生物分析的工作原理，电化学分析方法是将化学信息转换成可测量的电学信号，包括伏安信号、电位信号、电导信号或阻抗信号。与传统的免疫分析方法相比，电化学免疫分析方法具有简单易行、携带方便、可进行现场、实时、自动化检测等优点，被广泛应用于医疗护理、环境检测和食品安全的检测中。电子器件的低成本和大规模生产是电化学方法更适合于高通量商业化分析的另一个原因。

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图 1-2 基于石墨烯纳米片同时检查癌胚抗原和甲胎蛋白的免疫电化学电化学免疫传感原理图[6].2 压电免疫分析Sauerbrey 是第一个提出压电效应的人，并推导出公式（如图 1-3 所示）证明了频率化是由增加的质量引起的[7]。在所有能够测量表面质量变化的物理传感器中，压电是一个经济有效的替代品。许多类型的材料（石英、电气石、铌酸锂或钽酸锂、定化锌或氮化铝）都表现出压电效应，但石英的特性使其成为分析应用中最常见的晶料。压电免疫分析是采用石英晶体作为传感器元件(石英晶体微天平)，在微重力模工作，具有成本效益高、检测直接、实验简单、输出实时等优点。在 20 世纪 90 年压电分析方法被认为不如其他类型的分析方法灵敏。然而，随着压电传感器功能理完善和许多成功应用的报道，这种情况发生了改变。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.3;R446.6

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