基于荧光免疫层析技术的肺炎支原体快速检测方法的建立

发布时间：2017-03-21 12:06

  本文关键词：基于荧光免疫层析技术的肺炎支原体快速检测方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是一种常见引起原发性非典型肺炎的呼吸道病原体,20%左右的社区获得性肺炎即由MP感染的,对人类,尤其是儿童和老人来说,其越来越高的发病率已经引起了人们的担心。感染的早期诊断对于病人的及时治疗和诊断结果非常重要。但是,仍然缺少快速、简便的MP血清学检测方法。常见的酶联免疫吸附试验方法费时费力,操作繁琐;胶体金法灵敏度和特异性不高,存在不能定量的缺陷。本研究采用荧光素Alexa Fluor?647作为标记分子,建立了在血清中检测MP的免疫层析技术方法,使MP的临床检测更加准确、快速、灵敏。方法:建立肺炎支原体特异性Ig M抗体的免疫层析检测方法,并对其性能进行评价。将小鼠抗人Ig Mμ链特异性抗体以及羊抗兔Ig G标记上荧光素Alexa Fluor?647,MP天然抗原和重组抗原P1混合包被于硝酸纤维素膜的检测线T(test line)位置,兔Ig G包被于硝酸纤维素膜的质控线C(control line)。MP天然抗原和重组抗原P1在T线结合Ig M-anti-Ig M-AF647复合物,兔Ig G在C线结合anti-Ig G-AF647。通过荧光仪检测仪检测C、T位置的荧光值并计算其峰面积。采用本方法制备试纸条,对34份MP阳性血清和166份MP阴性血清进行检测,通过统计学软件SPSS 16.0中受试者工作曲线分析得到本方法的临界值,临界值以上判定为阳性,临界值以下判定为阴性。在此基础上考察了本方法的灵敏度,特异性,精确度以及稳定性。通过386份血清样本的检测,比对本方法与市售欧盟试剂盒的符合率和kappa系数等。结果:本研究建立基于荧光素免疫层析技术的肺炎支原体特异性Ig M抗体的检测方法。本方法的最佳检测时间确定为10min,选择赛多利斯的CN140作为本方法的硝酸纤维素膜,确定了海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮在保证试纸条稳定性方面的主要作用。通过检测34份阳性血清和166份阴性血清,ROC曲线分析结果得出Cutoff值为0.3830。ROC曲线下面积AUC为0.986(p0.001)。本方法与其他几种引起呼吸道感染的常见细菌和病毒病原体没有交叉反应。本方法的批间批内差异分别在3.28%到10.14%之间。本方法制备的试剂条保存时间能够达到2年以上。本方法与欧盟试剂盒检测方法比对结果显示,总体符合率达到了96.37%(Kappa=0.842,p0.001)。综上所述,本研究提供了一种快速便捷的早期诊断肺炎支原体特异性Ig M抗体的检测方法。
【关键词】：Alexa Fluor 647 人IgM 免疫层析技术 肺炎支原体
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R375.2;R446.6
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 英汉缩略词表9-10
• 1 引言10-14
• 1.1 免疫分析技术概况10-13
• 1.1.1 免疫标记技术的发展概况10-12
• 1.1.2 免疫层析技术概述12
• 1.1.3 荧光免疫层析技术的发展以及趋势12-13
• 1.2 肺炎支原体的介绍13-14
• 1.3 本文的主要研究内容14
• 2 材料与方法14-22
• 2.1 原理14-15
• 2.2 试剂与仪器15-17
• 2.2.1 试剂和耗材15-16
• 2.2.2 仪器16
• 2.2.3 主要溶液配制16-17
• 2.3 荧光免疫层析试剂的制备和优化17-22
• 2.3.1 荧光免疫层析试剂的制备17-20
• 2.3.2 荧光免疫层析方法的优化20-21
• 2.3.3 ROC曲线确定Cutoff值21
• 2.3.4 性能评价21-22
• 3 结果22-34
• 3.1 荧光免疫层析方法的优化22-29
• 3.1.1 最佳抗原包被比例的确定22-23
• 3.1.2 最佳NC膜的选择23-24
• 3.1.3 最佳检测时间的确定24-25
• 3.1.4 最佳表面活性剂的选择25
• 3.1.5 荧光抗体复合物保存液的选择25-28
• 3.1.6 ROC曲线确定Cutoff值28-29
• 3.2 性能评价29-34
• 3.2.1 特异性考察29
• 3.2.2 灵敏度考察29-31
• 3.2.3 精密度考察31-32
• 3.2.4 稳定性考察32-33
• 3.2.5 与欧盟试剂盒的比对33-34
• 4 讨论34-35
• 5 结论35-36
• 参考文献36-39
• 附录39-41
• 本人简历39-40
• 在学期间的研究成果目录40-41
• 致谢41-42
• 文献综述42-47
• 参考文献46-47

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1 刘R，

本文编号：259620