McSNP分型方法的建立及FOXO3A非编码区SNP对基因表达水平的影响

发布时间：2020-03-24 22:53

【摘要】：目的:1.采用McSNP法对位于人FOXO3A非编码区SNP位点分型。2.制作FOXO3A及GAPDH内参基因的质粒标准品,构建可长期、间断性地对大量临床来源样本进行FOXO3A基因表达的定量检测体系。3.分析SNP型对FOXO3A基因表达水平的影响。方法:1.分离14位健康献血者的单个核细胞(PBMC),从中提取基因组DNA及总RNA。2.McSNP分型方法的建立。首先设计包含SNP位点的特异性PCR扩增引物,应用该引物进行PCR反应,然后用限制性内切酶切割PCR产物,最后应用熔解曲线方法分析酶切产物,确定SNP型。应用PCR-限制性核酸多态性分析(PCR-RFLP)及PCR产物测序法对分型结果进行验证。3.FOXO3A基因表达定量体系的建立。采用TA克隆的方法构建pGMT-FOXO3A、pGMT-GAPDH重组质粒,获得定量标准品,使用该标准品制作定量标准曲线。设计用于FOXO3A基因表达定量的特异性扩增引物,对标准品进行多次重复定量检测,计算定量结果的精密度与偏倚,评价定量体系的可检测范围。4.对10份来源于健康献血者的DNA及RNA样本进行rs4946936分型和FOXO3A基因表达定量。应用统计学软件SPSS做独立样本T检验,比较组间的基因表达水平差异。结果:1.14位献血者rs4946936的McSNP分型结果及5位献血者rs2802288的McSNP分型结果均与RFLP分型法所得结果一致,PCR产物测序也验证了上述分型结果的准确性。McSNP分型法中rs4946936为TT型样本的熔解曲线显示为Tm值为77.25℃的单峰,TC型显示为Tm值为77.25℃和71.75℃的双峰,CC型显示为Tm值为71.25℃单峰。2.TA克隆蓝白斑筛选实验显示质粒连接、转化成功,对阳性克隆采用PCR法鉴定,显示质粒中含有目的片段。将质粒作为标准品梯度稀释制作定量标准曲线,扩增效率在0.9-1.1之间,相关系数98%,FOXO3A定量结果显示样本基因表达水平在1.56×10~6-1.56×10~3copies/μl(Ct值20~30)范围内精密度变异系数小于5%,偏倚小于7.5%。3.10位献血者rs4946936 McSNP分型结果显示6个样本为CC型,3个样本为TC型,1个样本为TT型。rs4946936 T突变型组(TT和TC型)与CC型组相比,FOXO3A基因表达水平未见统计学差异,p0.05。结论:1.成功建立了基于熔解曲线分析的McSNP分型方法。2.构建了可长期对间断来源样本的FOXO3A基因表达量进行比较的检测体系。3.对10份献血者的基因表达水平分析,未见不同rs4946936型别个体间FOXO3A基因表达水平具有明显差异。
【图文】：

图 2 rs2802288-s 酶切产物的熔解曲线2.McSNP分型结果使用 McSNP 法对 14 个不同个体的 rs4946936 分型结果是：样本 2、3、4、6、8、9、12、13 为 CC 型，，样本 1、5、7、11、14 为 TC 型，样本 10 为 TT 型。 对

图 1 rs4946936-s酶切产物的McSNP熔解曲线对5份DNA样本，使用引物对rs2802292s-F/rs2802288s-R进行PCR扩增，使用t1消化覆盖rs2802288位点的PCR产物，熔解曲线分析显示：GG型样本熔解曲线示为单峰，AG型显示为三峰，AA型显示为双峰，见图2。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R440

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 郑星星;王建刚;;FoxO3a转录因子与心血管疾病的研究进展[J];心脏杂志;2014年02期

2 裴艳宏;刘坤祥;;FOXO3a转录因子的研究进展[J];泰山医学院学报;2013年04期

本文编号：2598982