CD248蛋白作为慢性肾脏病尿液标志物的应用研究

发布时间：2020-03-26 19:44

【摘要】：[背景]慢性肾脏疾病是各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍,肾间质纤维化为慢性肾脏疾病的主要病理改变之一。病理结果是纤维化诊疗研究中最为直接的诊断证据,但是作为有创检查,在临床应用受到限制。血清学指标Ⅲ型胶原蛋白、GFR、白蛋白肌酐比等,影像学超声弹性成像、剪切波弹性成像等方法因可重复、无创受到研究者关注。纤维化过程复杂,涉及细胞和分子众多,目前的指标虽然通过不同角度直接或间接反应患者纤维化水平,但是特异性存在不足,研究认为肌成纤维细胞非可逆活化作为纤维化中至关重要一个节点,但是缺乏相应的检测指标。特异性标记物筛选仍旧是纤维化研究和诊疗过程最为主要的挑战。CD248(内皮唾液酸蛋白),属于Ⅰ型跨膜糖蛋白。近期研究证实在病理性纤维化疾病中CD248的表达明显上调。并且其表达程度与组织的纤维化程度成正相关关系。研究认为其与肌成纤维细胞活化密切相关,我们的研究也确定干扰CD248分子可以影响纤维化进程。CD248分子能否作为慢性肾脏疾病纤维化进程新型诊断标志物受到关注。[研究目的]本研究以尿蛋白阳性患者尿液样本为研究对象,通过检测尿液中CD248蛋白,结合患者其它肾损伤相关指标以及疾病特征进行分析,从而探讨CD248蛋白能否作为慢性肾脏病新型尿液标志物。[方法]1.CD248特异性单克隆抗体制备:采用原核表达CD248重组蛋白免疫小鼠,取免疫成功小鼠脾脏,PEG细胞融合法进行融合获得杂交瘤细胞,间接ELISA筛选CD248阳性杂交瘤细胞株;杂交瘤细胞小鼠腹腔注射后,辛酸-硫酸铵法纯化腹水中抗体,SDS-PAGE鉴定抗体纯化效果;免疫印迹分析抗体与CD248重组蛋白、SJSA-1细胞CD248蛋白反应情况、流式细胞仪检测抗体与SJSA-1细胞膜蛋白CD248反应情况;ELISA检测抗体亲和力情况。2.临床标本验证:随机挑选5例蛋白尿样本,免疫印迹检测尿液CD248蛋白。收集137例尿液标本(健康人尿:10例;Non-CKD蛋白尿:22例;CKD蛋白尿:105例)。其中糖尿病肾病34例;肾移植状态13例;IgA肾病9例;慢性肾小球肾炎49例。收集样本采集当日的血肌酐、胱抑素C以及疾病病程相关数据,免疫印迹法检测慢性肾脏疾病患者尿液样本CD248,非参数检验(行×列表资料的χ2检验)分析与CKD分期、CRF血肌酐分期、胱抑素C含量、疾病病程之间的相关性。[结果]1.筛选出6株CD248特异性单克隆抗体(M3F、M3H、M4A、M4B、M4C、M5)。免疫印迹结果显示6株抗体均能与MBP-CD248重组蛋白以及SJSA-1表达的CD248蛋白结合;流式细胞检测中有3株抗体能够与SJSA-1表达的CD248蛋白结合分别为:M3F、M4C、M5;6株抗体的亲和力分别为(单位:mM):M3F:0.07、、M3H:0.07、、M4A:0.08、、M4B:0.10、M4C:0.05、M5:0.32。2.①免疫印迹分析得出CD248在蛋白尿中存在表达;②在Non-CKD中CD248的阳性率为:13.6%,在CKD尿液中CD248阳性率为:53.3%;P0.05③CKD1-5期尿液中CD248的阳性率分别:33.3%、53.3%、55.5%、51.7%、61.3%;P0.05④在CRF肌酐分期中,5组的CD248的阳性率分别为:36.6%、61.5%、50%、62.5%、66.7%;P0.05⑤胱抑素C正常参考值组CD248阳性率:33.3%,大于参考值上线组阳性率:61.2%;P0.05⑥糖尿病肾病病程1-5年、5.1-10年、10.1年以上各组CD248的阳性率分别为:50%、52%、66.7%;P0.05;各组CKD的分布情况P0.05;⑦将肾移植分为移植5年内与移植5年以上,CD248阳性率分别为:14%、50%;两组CKD的分布情况P0.05。[结论]1.6株抗体均能与CD248蛋白变性表位结合;3株抗体能够结合CD248空间构象位点;6株抗体的亲和力检测中M5亲和力最高。2.CD248可具有作为慢性肾脏疾病早期检测标志物的潜能,以及在反应疾病病情进展上尿液中CD248的表达情况可能较CKD更具有临床价值。
【图文】：

重组蛋白,振荡培养,菌液,纯度

３０摄氏度，２５０ｒｐｍ振荡培养，收集振荡培养５ｈ时的菌液。对收集到逡逑的菌液进行裂解和超声碎菌后进行梯度尿素洗涤得到纯化后的目的蛋白。用逡逑ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋（图１－１）对目的蛋白进行纯度验证，成功获得诱导表达ＭＢＰ－ＣＤ２４８逡逑蛋白，其纯化后纯度较高，，分子量与预期相符。逡逑ＫＤａ邋Ｍ邋１逡逑１７０－逡逑１３０－逡逑１００－邋＊逡逑７５－逡逑６０－逡逑４５－逡逑３５－逡逑２５－逡逑图１－１邋ＭＢＰ－ＣＤ２４８重组蛋白纯化结果逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｐｕｒｉｆｙ邋ｏｆ邋ＭＢＰ－ＣＤ２４８邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑２３逡逑

血清效价,小鼠,小鼠血清

小鼠血清从１：１邋000起每２倍倍比稀释，直至血清稀释至１：１邋０００邋０００。逡逑相关抗体孵育结束后进行显色和酶标仪检测读数。检测结果发现免疫的４只小逡逑鼠血清中的ＣＤ２４８抗体效价均达到１００００００邋（图１－２；邋１－３），此时的小鼠可用逡逑于接下来的杂交瘤细胞融合实验。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑？逦－ｔ－逦－逦’邋ｔ逡逑２－ｓ逦ｕｎｋｗｒｉｎｎｉｚｅｄ逦２５逦－＃－Ｎ０．２邋－＃－ｕｎｉｍｍｏｎｕｅｄ逡逑Ｉ邋２逦Ｉ邋２逡逑ｒｏ逦＾逡逑Ｈ逦＼逦１－逦＼逡逑ｉ１逦＼逦１１邋Ｖ逡逑0邋？邋？邋ｋ邋￣？－？？？〉ｏ邋？—？？＿？＿？＿？＿￣逡逑／邋／邋／邋／／／／／／，／／／邋／邋／邋／邋／／／／／，＜／／逡逑图１－２逦１－２号小鼠免疫完成后血清效价逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｓｅｒｕｍ邋ｔｉｔｅｒ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍｏｕｓｅ邋Ｎｏ．邋１－邋２逡逑Ａ：１号小鼠Ｂ：邋２号小鼠逡逑蓝色线条：免疫结束后小鼠血清效价；红色现条：阴性对照血清逡逑２４逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692;R446.1

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