高分辨率熔解曲线分析技术在Klinefelter综合征快速筛查中的多中心应用研究

发布时间：2020-03-26 22:14

【摘要】：克氏综合征(Klinefelter Syndrome,KS)是由于男性性染色体中存在额外的X染色体而表现出的一组症候群,是男性最常见的性染色体异常疾病之一,也是导致男性不育的最常见原因。KS的发病率在新生儿男婴中为0.1-0.2%,在男性不育患者中为3%,在非梗阻性无精少精症患者中为10%-12%。越来越多的证据表明,如果在适当的时机为KS患者提供治疗和干预措施,如睾酮替代疗法和睾丸精子提取术等,不仅能有效地提高患者的生活质量,延缓并发症的发生发展,还能降低KS发病率及提高人口质量。然而不幸地是,大多数克氏综合征患者并没有得到确诊,仅有25%的KS患者得到诊断,且在这些患者中多数是在成年期发现有不育症时才被确诊,而此时他们已错过最佳的生育治疗时机,承受着生理上和心理上的双重负担。因此,开展KS疾病的人群筛查是提高克氏综合征诊断率的重要措施。目前用于克氏综合征的检测方法主要有核型分析、荧光原位杂交技术(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)、多重连接探针扩增技术(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification,MLPA)和实时定量 PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)等技术,但这些技术方法在操作简便性、检测成本、临床灵敏度和特异性等方面存在一定的局限性,而不能大规模应用于临床筛查。高分辨率熔解曲线(HighResolutionMelting,HRM)分析方法作为一种分子遗传诊断领域的新技术在疾病筛查方面的应用日渐广泛。为此,本研究旨在建立一种简单快速的可用于人群克氏综合征筛查的HRM检测方法,通过三个医疗中心对共计1373例临床样本的检测,评估其临床灵敏度和特异性。HRM检测方法是利用同一引物对同时扩增ZFX基因和ZFY基因的特异性片段,正常男性ZFX/ZFY的比值为1,而克氏综合征病例的ZFX/ZFY的比值会发生改变,因此正常男性和KS形成的熔解曲线会有所不同,可以在数据分析过程中加以区分。我们评估了 HRM检测方法的检测限、截断值(Cut-off值)以及临床灵敏度和特异性。同时,为了发掘HRM分析技术在新生儿克氏综合征筛查的应用潜力,还收集了 60例新生儿干血片样本进行检测。实验结果表明本研究所建立的基于HRM技术的人群克氏综合征筛查体系DNA模板量的检测限度范围大(5-50ng),对KS嵌合体类型具有高分辨率,高临床灵敏度(100%)和高特异性(99.8%)。此外,该筛查体系检测重复性好、通量高、高效快速(2h)、成本低、操作简单易于自动化,并且外周血和干血片样本均能检测。因此,HRM分析技术可以作为基于产后KS人群筛查的优选方法,可用于不同年龄阶段的筛查。
【图文】：

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ＤＮＡ的解链过程。高分辨率焰解曲线技术原理是：在常规的ＰＣＲ反应之后对产逡逑物进行溶解曲线分析，加入的饱和型荧光染料在ＰＣＲ反应后会与其产物相结合，逡逑如图１，此时的荧光信号值最大，随后对ＰＣＲ产物进行加热升温，在温度升高逡逑的过程中，双链ＤＮＡ逐渐发生解链行为，当双链ＤＮＡ解成单链ＤＮＡ时，荧光逡逑染料分子也会逐渐地从双链ＤＮＡ上释放出来，荧光信号会随之逐渐减弱。由于逡逑组成双链ＤＮＡ的核苷酸不同，，Ｔｍ也不同，通过实时监测温度变化过程中焚光逡逑强度信号值的变化，以此形成的熔解曲线就可以对双链ＤＮＡ做出分析。不同位逡逑点、ＧＣ含量、扩增长度等都是影响熔解曲线峰形的因素从而会形成不同形态的逡逑熔解曲线，因此可以通过恪解曲线将ＤＮＡ原始序列中存在的差异较为直观地展逡逑示出来。逡逑１０逡逑

高分辨率熔解曲线分析技术在Klinefelter综合征快速筛查中的多中心应用研究

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【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R596;R440

【参考文献】