肿瘤特异性启动子PEG3驱动报告基因FTH1在干细胞瘤变时表达及MR成像

发布时间：2020-03-27 06:16

【摘要】：背景与目的干细胞移植在中枢神经系统及心血管系统等多系统疾病治疗的研究领域中取得了显著地进展,但干细胞与肿瘤细胞关系密切,都具有自我更新和多向分化能力,不仅有相似的代谢活性,而且有很多相同的沉默基因。近年来关于干细胞成瘤的报道使干细胞移植安全性被质疑,而且移植部位常发生在脊髓、脑、眼等较敏感的部位,即使形成很小的肿瘤都会导致严重的功能障碍,移植后干细胞的示踪可尽早检测到肿瘤的发生。在干细胞活体影像学示踪领域,主要利用光学、核医学以及磁共振成像(MRI),其中,MRI因具有三维多序列成像且高分辨率无辐射等优点而最具潜力。MRI示踪干细胞常用方法包括直接和间接两种方法,直接示踪法应用磁性纳米微粒先标记干细胞并利用MRI对磁标记细胞进行检测,但是由于细胞的分裂及再摄取等问题限制其对干细胞的长期纵向示踪;间接示踪法常采用MRI报告基因标记干细胞,并利用其在细胞内的持续表达来示踪干细胞,有效克服了直接示踪法不能对细胞进行长期示踪的缺陷。虽然MRI报告基因成像可实现对干细胞移植后的长期纵向示踪,但无法区分早期瘤变细胞和瘤变前的干细胞。解决这一问题的关键在于找到一种在干细胞瘤变前后差异化表达的基因,该基因在瘤变细胞内高表达,而在干细胞及其正常分化的组织细胞不表达或低表达,利用该基因的启动子驱动报告基因在瘤变细胞内特异性表达,理论上可以实现报告基因成像对干细胞瘤变的早期检出。PEG3(progression elevated gene-3)是一种来源于啮齿动物的肿瘤特异性基因,在肿瘤细胞中,PEG3启动子活性受到PEA3、AP-1两种转录因子的调节而高表达。该基因在人癌细胞系同样高表达,而在正常组织细胞极少表达;目前PEG3启动子已被用于肿瘤的靶向治疗和肿瘤的发生机制等研究领域。有关利用PEG3启动子驱动报告基因对干细胞瘤变进行活体成像的研究尚未见文献报道。本实验将肿瘤特异性启动子PEG3与MRI报告基因FTH1相结合,构建PEG3-FTH1-LV慢病毒载体,将PEG3-FTH1系统转入大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)内,并诱导MSCs瘤变,在诱导前后观察FTH1基因表达、聚铁效应以及MRI信号改变,探究利用PEG3启动子驱动MRI报告基因FTH1在干细胞瘤变时特异性表达及聚铁,并被MRI检测的可行性。方法1 PEG3-FTH1-LV慢病毒载体的构建及病毒包装PEG3启动子、FTH1基因(委托汉恒生物有限公司合成)与载体p HBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZSgreen-puro通过酶切、扩增、连接得到pHBLV-PEG3-FTH1-3flag-EF1-ZSgreen-puro,测序鉴定构建成功后与质粒(p SPAX2、p MD2G)同时感染293T细胞,收集病毒液离心得到病毒并标记为PEG3-FTH1-LV。同时构建CMV-FTH1-LV作为阳性对照,并将未感染病毒的MSCs细胞作为阴性对照。2慢病毒感染MSCs并诱导瘤变待MSCs细胞融合度达30%-40%,分别添加含PEG3-FTH1-LV、C MV-FTH1-LV病毒培养基,感染48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,嘌呤霉素筛选构建稳定表达株MSCs-PEG3-FTH1、MSCs-CM V-FTH1。将MSCs、MSCs-PEG3-FTH1、MSCs-CMV-FTH1分别与大鼠胶质瘤细胞C6间接共培养2周诱导其瘤变为TMSCs、TMSCs-PEG3-FTH1、TMSCs-CMV-FTH1。3诱导前后细胞的鉴定观察共培养前后细胞形态,细胞流式检测共培养前后细胞表面抗体CD29、CD34、CD45、CD90表达情况,结晶紫染色检测诱导前后细胞迁移能力,CCK-8检测诱导前后细胞增殖速度,裸鼠皮下成瘤实验验证细胞瘤变。4诱导前后细胞FTH1表达及聚铁Western blots检测诱导前后细胞FTH1表达,诱导前后细胞分别经FAC培养基作用72h后,3.0T MRI观察细胞T2WI信号,普鲁士蓝染色、细胞透射电镜观察细胞诱导前后FTH1基因表达所引起的聚铁效应。5诱导后细胞移植物聚铁效应检测选取4-6W、20g左右健康雄性裸鼠,将诱导后细胞种植于裸鼠颈背部皮下,每天500mmol/L FAC溶液喂养,于细胞种植后第1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d行3.0T MR观察移植物T2WI信号;细胞移植后形成的移植物取出后行普鲁士蓝染色及透射电镜观察肿块内铁颗粒情况,行苏木素-尹红染色观察其病理结构。结果1 PEG3-FTH1-LV慢病毒载体的鉴定及病毒包装经DNA测序、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳等技术测定已成功构建PEG3-FTH1-LV慢病毒载体,病毒滴度为1×108TU/ml。2稳定株的建立慢病毒感染细胞48h后绿色荧光明显表达,嘌呤霉素筛选7天再半量筛选3天后成功构建MSCs-PEG3-FTH1、MSCs-CMV-FTH1稳定株。3诱导前后细胞的鉴定显微镜下观察到MSCs细胞排列整齐,呈鱼群样生长,TMSCs细胞较MSCs细胞变小,核浆比变大,并排列紊乱;经CCK-8检测显示TMSCs细胞较MSCs细胞增殖速度加快;结晶紫染色结果显示TMSs细胞较MSCs细胞迁移能力增强;流式细胞检测结果分析得到TMSCs细胞较MSCs细胞CD34、CD45表达增加,CD90表达减少;裸鼠皮下成瘤实验显示TMSCs细胞裸鼠皮下成瘤阳性,而MSCs不形成肿瘤。4诱导前后细胞FTH1表达及聚铁效应Western blots结果显示MSCs、MSCs-PEG3-FTH1、TMSCs细胞不表达或少量表达FTH1蛋白,而MSCs-CMV-FTH1、TMSCs-PEG3-FTH1、TMSCs-CMV-FTH1细胞均大量表达FTH1蛋白,MRI显示T MSCs-PEG3-FTH1细胞T2WI信号较MSCs-PEG3-FTH1细胞明显降低。普鲁士蓝染色和细胞透射电镜观察到MSCs-CMV-FTH1、TMSCsPEG3-FTH1、TMSCs-CMV-FTH1细胞内存在铁颗粒,而在MSCs、M SCs-PEG3-FTH1、TMSCs细胞内无明显铁颗粒。5诱导后细胞移植物体内聚铁效应MRI显示TMSCs-PEG3-FTH1细胞移植物信号与TMSCs-CMV-FT H1细胞移植物信号相似且均较TMSCs细胞移植物信号降低,普鲁士蓝染色和细胞透射电镜均观察到TMSCs-PEG3-FTH1与TMSCs-CMVFTH1细胞移植物内有明显的铁颗粒而TMSCs细胞移植物内铁颗粒不明显。结论本实验成功构建PEG3启动子控制FTH1基因表达的慢病毒载体并感染MSCs细胞,证实了PEG3启动子可驱动报告基因FTH1在干细胞瘤变时特异性表达并能被MRI检测。
【图文】：

重庆医科大学硕士研究生学位论文正置显微镜 OLYMPUS纯水仪 Millipore0.22um 混合纤维素滤膜 Millipore细胞计数板 上海医用仪器厂细胞培养瓶及培养板 Costar1.3 慢病毒载体、菌株和细胞株1.3.1 病毒包装系统慢病毒载体和包装质粒 pMD2G、pSPAX2 （图 1）。

ACCAACGAGGTGGCCGAATCTTCCTTCAGGATATCAAGAAACCAGACTGTGATGACTGGGAGAGCGGGCTGAATGCAATGGAGTGTGCATTACATTTGGAAAAAAATGTGAATCAGTCACTACTGGAACTGCACAAACTGGCCACTGACAAAAATGACCCCCATTTGTGTGACTTCATTGAGACACATTACCTGAATGAGCAGGTGAAAGCCATCAAAGAATTGGGTGACCACGTGACCAACTTGCGCAAGATGGGAGCGCCCGAATCTGGCTTGGCGGAATATCTCTTTGACAAGCACACCCTGGGAGACAGTGATAATGAAAGCGGATCCTCGGTACCAAGCTTAAGTGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATAAAGATCCATCGATACTAGTAAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAG与正确序列对比结果显示无误（图 2）；
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R445.2;R457.7

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 修雁,陈绍亮;报告基因核医学显像及研究进展[J];中华核医学杂志;2003年06期

2 曾yN青,吴鹤龄;报告基因——哺乳类动物遗传学研究的新工具[J];生物工程进展;1992年03期

3 王弘,郑文岭,杨连生,于淑娟,赖晃文,杨传红,马文丽;以绿色荧光蛋白为报告基因的酿酒酵母表达载体的构建[J];广东医学;2002年12期

4 尤崇革,周旭,侯玲,李益民;绿色荧光报告基因在细胞免疫检测中的应用[J];微生物学免疫学进展;2002年01期

5 胡春霞;叶梦情;岑益超;易明花;;以绿色荧光蛋白为报告基因的环境砷离子生物检测体系的构建[J];环境与健康杂志;2013年07期

6 王玲;董关木;;绿色荧光蛋白报告基因在病毒检测中的应用及研究[J];微生物学免疫学进展;2008年04期

7 于红,赵磊,张文卿,张学成;建立以EGFP为报告基因检测HSV感染的细胞株[J];中华微生物学和免疫学杂志;2004年10期

8 李强;植物基因工程中常用的报告基因[J];生物学杂志;1995年01期

9 徐丹丹;陈宏伟;方向明;;铁蛋白报告基因在肿瘤分子影像中的研究进展[J];临床放射学杂志;2019年02期

10 王劲 ,张雪林;酪氨酸酶基因作报告基因的磁共振分子影像学研究进展[J];国外医学(临床放射学分册);2004年04期

相关会议论文 前10条

1 侯颖;张大铭;;报告基因在哺乳动物细胞中表达的研究[A];中国动物学会兽类学分会第六届会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2004年

2 莫志成;李晓燕;李宏帆;程小款;吴宁华;沈s輙2;;竞争RT-PCR定量检测氯霉素乙酰基转移酶mRNA水平方法的建立及初步应用[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年

3 裴之俊;兰晓莉;覃春霞;王朋;何勇;田月丽;张永学;;多功能报告探针的制备及应用多模态分子显像监测干细胞的可行性研究[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年

4 张一帆;李彪;江旭峰;冯国伟;朱承谟;;NIS基因作为报告基因的可行性研究[A];第三届全国核素显像暨核素治疗学术交流会论文汇编[C];2006年

5 张一帆;王俊;周翔;李彪;朱承谟;;NIS基因作为报告基因的可行性研究[A];第四届全国中青年核医学学术会议论文汇编[C];2008年

6 申宝忠;王凯;王可铮;王知非;黄涛;李伟华;王丹;;转铁蛋白受体报告基因MR分子成像监测内皮抑素基因表达及治疗效果[A];中华医学会第16次全国放射学学术大会论文汇编[C];2009年

7 覃春霞;兰晓莉;夏晓天;张永学;;新型报告基因/报告探针系统hERL/~(18)F-FES的评估[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年

8 张尔婷;江娜;刘清;李华平;朱慧兰;;以分泌型荧光素酶为报告基因的Nrf2报告系统的建立与验证[A];2016全国中西医结合皮肤性病学术年会论文汇编[C];2016年

9 伍仕敏;周新;杨华芬;刘永学;;基于报告基因的PPRE转录调节模型的建立及应用[A];全国第2届中西医结合传染病学术会议暨国家中医药管理局第1届传染病协作组会议论文汇编[C];2008年

10 王丹;陆葵青;包骐林;胡景清;宋杰;周明明;周林桦;李云;;环境内分泌干扰物筛查方法的建立[A];第十三届中国西部营养与健康高峰论坛论文集[C];2018年

相关重要报纸文章 前1条

1 记者 李天舒　通讯员 朱丹萍;可携带报告基因的甲型流感病毒“人造”成功[N];健康报;2011年

相关博士学位论文 前10条

1 柳梅;酪氨酸酶报告基因用于干细胞移植后心梗模型多模态显像[D];华中科技大学;2018年

2 吕靖;报告基因及GLP-1受体显像对移植细胞长期监测的可行性研究[D];上海交通大学;2017年

3 邵阳光;可逆性组蛋白乙酰化修饰在人WT1基因转录调控中的作用及其分子机制研究[D];东北师范大学;2005年

4 徐莉春;环境内分泌干扰物筛选的受体报告基因试验研究[D];南京医科大学;2005年

5 茆灿泉;报告基因（lux，，GFP）载体的构建和在肿瘤细胞及组织中表达的研究[D];中国协和医科大学;1999年

6 韩卿;JNK3与p65相互作用的分子机制及其功能研究[D];重庆医科大学;2008年

7 代晓朋;microRNA-15b在乙型肝炎病毒复制中的作用及分子机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2015年

8 张颖;汉坦病毒非编码区调控功能的研究应用及粘膜免疫初探[D];山东大学;2009年

9 张龙;Dpr1和Dpr2在调节Wnt/TGF-β信号中的作用[D];清华大学;2008年

10 陈云飞;USP21负调控STING介导的Ⅰ型干扰素信号通路的激活功能及其机制的研究[D];华东师范大学;2014年

相关硕士学位论文 前10条

1 孙君;肿瘤特异性启动子PEG3驱动报告基因FTH1在干细胞瘤变时表达及MR成像[D];重庆医科大学;2019年

2 莫丽芬;鸡Dazl荧光报告基因追踪生殖细胞迁移和分化的研究[D];广西大学;2019年

3 贾春翠;报告基因法检测重组人sgp130-Fc融合蛋白生物学活性[D];中国食品药品检定研究院;2019年

4 李一沛;树突状细胞核蛋白-1的功能研究[D];苏州大学;2016年

5 杨玉帅;报告基因法测定重组人促红素生物学活性研究[D];中国食品药品检定研究院;2014年

6 徐小林;雌激素受体介导的报告基因试验方法的建立[D];南京医科大学;2008年

7 贾瑞瑞;Dip2a-LacZ报告基因小鼠模型的制作及表达分析[D];东北师范大学;2015年

8 李晨;表达双报告基因的慢病毒颗粒的制备及体外标记小鼠间充质干细胞[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年

9 赵海涛;基于报告基因的环境（抗）雌激素和环境（抗）雄激素体外细胞检测系统的建立[D];第二军医大学;2005年

10 Aweya Jude Juventus;蛋白激酶D1（PKD1）在HIV-1复制中的作用[D];厦门大学;2009年

本文编号：2602588