胶质细胞源性神经营养因子对脓毒症大鼠骨骼肌烟碱型乙酰胆碱受体异化重构的影响及作用

发布时间：2020-03-29 19:11

【摘要】：目的:研究胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)对因为脓毒症而出现的骨骼肌烟碱型乙酰胆碱受体异化重构的调控作用,然后深入研究该因子对脓毒症大鼠骨骼肌神经肌肉功能障碍的改善作用。方法:选取健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠60只,在对它们进行研究时采用随机数字表的方法把60只大鼠平均分为六个小组(n=10):假手术组(sham组),4小时组(4 h组),6小时组(6 h组),12小时组(12 h组),24小时组(24 h组)和GDNF+24小时组(GDNF+24h组),sham组仅进行开腹盲肠探查,其余组均进行盲肠结扎穿孔术(Cecal ligation and puncture,CLP)构建相应的脓毒症模型。对于每个小组,在进行建模或假手术后的1小时内,从大鼠的腹主动脉以及尾静脉中抽取一定量的血液作为样本,然后通过ELISA法对所取的样本进行检测,检验血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的含量,然后对其进行建模或进行假手术,观察观察大鼠的存活率以及各个大鼠活动的距离和进行直立的次数。麻醉大鼠,解剖分离大鼠坐骨神经,测定大鼠在体胫前肌复合动作电位(Compound muscle action potential,CMAP),高浓度二氧化碳处死大鼠,采集所需要的标本。取大鼠的胫前肌,通过免疫荧光法准确测量γ-nAChR,α7-n ACh R和GFR-α在大鼠胫前肌细胞膜上具体的排列方式以及表达方式;然后运用Western-blot对所选择标准中的γ-n AChR,α7-nAChR,neuregulin-1,GFR-α,ERK1/2和GDNF的蛋白具体表达数量进行详细准确的测定。结果:(1)细胞因子水平:与sham组比较,CLP组IL-6以及TNF-α水平有着明显的提升,而且随着建模后时间点的不断延长,其水平含量也相应的逐渐增加,存在的差异在统计学上具有实际意义(P0.05)。(2)比较各组大鼠直立的次数:在直立次数比较中,CLP组较sham组直立次数明显减少,且随着CLP建模时间点的延长,大鼠直立次数逐渐下降,存在的差异在统计学上具有实际的意义(P0.05)。(3)大鼠在体胫前肌复合动作电位(CMAP)的比较:大鼠在体胫前肌复合动作电位的比较中,与sham组相比,CLP组动作电位的振幅,频率,传导速度和潜伏期较sham组均有所增加,且随着CLP建模时间点的延长,大鼠胫前肌动作电位相应的指标均逐渐增加,差异具有统计学意义(P0.05)。(4)采用免疫荧光法测定γ-nAChR,α7-nAChR和GFR-α在大鼠胫前肌细胞膜上的表达:γ-nAChR,α7-nACh R和GFR-α均在细胞膜上表达,与sham组相比,CLP组γ-nAChR,α7-nAChR和GFR-α的荧光强度有显著增强,且随着CLP建模时间点的延长,荧光强度逐渐增加。(5)Western-blot对所选择的标本中γ-nAChR,α7-nAChR,neuregulin-1,GFR-α,ERK1/2和GDNF的蛋白表达量进行准确的测定:与sham组相比,CLP组γ-nAChR,α7-nAChR表达增加,且随着建模时间点的延长γ-nAChR,α7-nAChR,GFR-α和ERK1/2表达逐渐增加,neuregulin-1和GDNF的表达逐渐降低,存在的差异在统计学上具有实际意义(P0.05)。结论:(1)脓毒症的存在在一定程度上会促使骨骼肌细胞膜上异质化的乙酰胆碱受体γ-nAChR,α7-nAChR的表达活性有所提升,并且遍布于骨骼肌整个细胞膜上。(2)在脓毒症急性期24小时内,随着时间的延长,大鼠骨骼肌CMAP呈现逐渐下降趋势,骨骼肌神经肌肉功能障碍逐渐加重。(3)在脓毒症急性期24小时内,随着时间的延长,γ-nAChR,α7-nAChR的表达逐渐增多,保护性因素neuregulin-1和GDNF的表达逐渐降低。(4)外源性给予GDNF可以通过减少γ-和α7-n AChR的表达,从而能够改善脓毒症导致的骨骼肌神经肌肉功能障碍。(5)GDNF是通过胞外信号调节激酶ERK1/2和GDNF受体GFR-α信号转导通路来发挥神经功能调节作用的。
【图文】：

实验要求的用均数土标准差（-X ±s 表示。且应用单因素方差（ANOVA)分析同组间的差异，应用 SNK-q 检验对比分析两组间的差异。以 P 是否小于 0.05 来确定其是否旅有统计学意义。2.结果2.1 脓毒症建模后表现2.1.1 动物行为学如下图 1 所示，Sham 组大鼠建模后活动以及饮食都无异常出现，在被抓取时能够反应敏捷地躲避，排泄物也正常。CLP 组大鼠在建模后进食量显著降低，毛发呈竖直状态，活动量也显著降低，身体蜷缩， 在被抓取时不能够反应敏捷地躲避。大鼠行为学示意图

able to avoid aggression and seizures when crawled. After CLP group rats were f intake was significantly reduced, the hair was vertical, the activity was signifced, the body was curled up, and it was not able to respond quickly when caught. 动物直立次数如图 2 所示，在完成建模或手术后在相同的时间阶段，对比分析 CLP 组 组，得出患有脓毒症的大鼠直立次数显著降低，且 P＜0.05 差异具有统。当 12 h 组和 24 h 组的大鼠与 sham 组进行对比时，发现 12h 与 24h 组的显著降低，且 p＜0.05 具有统计学意义。并且随着建模时间的延长，与 4h 组比较，24h 组的大鼠直立次数显著降低，且 P＜0.05 因此差异具有义。各组大鼠直立次数指标示意图
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7

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本文编号：2606398