【摘要】：【目的】轻度内质网应激是细胞对各种应激因子刺激的一种保护性反应,但持续或严重的应激可摧毁内质网的功能,进而影响线粒体的功能,促进细胞凋亡,加重缺血再灌注损伤。研究证实:4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid,4-PBA)是一种具有分子伴侣活性的短链脂肪酸,能通过抑制内质网应激来降低缺血再灌注损伤的程度,但在心脏骤停/心肺复苏(cardiac arrest/cardiopul monary resuscitation,CA/CPR)条件下,4-苯基丁酸是否还有类似的保护作用尚不清楚。本研究应用经食道电刺激方法建立大鼠CA模型,在CPR前经外周血管注入不同浓度的4-苯基丁酸,观察其对复苏后全脑缺血再灌注损伤是否有保护作用,通过检测复苏后大鼠脑组织的细胞凋亡情况,脑组织的内质网应激相关蛋白、三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)和Ca~(2+)含量的变化,脑组织线粒体钙离子摄入蛋白1(Mitochondrial calcium uptake1,MICU1)的蛋白表达量等,阐述其可能的作用机制。【方法】用经食道电刺激法建立6min的大鼠心脏骤停模型,随机抽签法将心脏骤停大鼠分为3组:每组分别注射1ml/Kg的2.5%的4-苯基丁酸(LG组,n=40),1ml/Kg的5%的4-苯基丁酸(HG组,n=40)以及1ml/Kg的生理盐水(NS组,n=40)后立即予CPR。如大鼠CPR至恢复自主循环(restoration of spontaneous circulation,ROSC)时间超过10分钟界定为复苏失败,不纳入实验组。再随机抽取大鼠做为假手术组(SH组,n=40),假手术组的大鼠只进行简单的麻醉、分离动静脉及插管,不进行电刺激。以上各组大鼠在复苏后24h(假手术组大鼠从手术开始24h)依然存活者被进一步分为4个亚组,每亚组10只大鼠(如果某一组大鼠存活至24h不足40只,可用同样的实验方法和步骤补足40只),分别检测以下指标:1、HE、TUNNEL:4组大鼠每组随机抽取1个亚组,断头取脑,做成蜡块,切片,进行HE染色,观察并比较4组大鼠脑组织HE染色的结果;进行TUNNEL染色,比较各组脑组织细胞凋亡的比例。2、GRP78蛋白,CHOP蛋白;4组大鼠每组随机抽取1个亚组,各组10只,取脑,匀浆,用western blot办法检测匀浆液中内质网应激相关蛋白。如葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78),转录因子C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)。3、三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)和Ca~(2+)含量;同上4组大鼠每组随机抽取1个亚组。取脑,匀浆备用,然后将匀浆液用于测定脑组织内ATP和Ca~(2+)含量。4、线粒体钙离子摄入蛋白1(Mitochondrial calcium uptake1,MICU1)蛋白表达量测定;剩余所有亚组,取脑匀浆后用蛋白印迹法检测MICU1的蛋白表达量。【结果】统计每组总共接受手术的大鼠分别为:假手术组40只,NS组56只,LG组52只,HG组48只,且最后每组成功入组40只。1、HE染色结果与SH组对比NS组的HE染色显示脑损伤较重,与NS组对比,HG与LG的脑损伤减轻。且HG组的脑损伤较LG组的脑损伤轻。2、TUNNEL凋亡结果与SH组对比,凋亡细胞在NS组的凋亡细胞百分比明显增高(P0.01);与NS组相比,LG组的凋亡细胞百分比明显下降(P0.01),HG组的凋亡细胞百分比也明显下降(P0.01);HG组与LG组比较,HG组的凋亡细胞百分比较LG组减少(P0.05)。3、内质网应激相关蛋白含量表达结果与SH组相比,GRP78蛋白在NS组的表达上调(P0.01);与NS组相比,GRP78蛋白在LG组的表达下调(P0.05),GRP78蛋白在HG组的表达也下调(P0.01);HG组与LG组对比,HG与LG组的GRP78蛋白表达比差异无统计学意义。与SH组相比,CHOP蛋白在NS组的表达增高(P0.01);与NS组相比,CHOP蛋白在LG组表达降低(P0.05),CHOP蛋白在HG组的表达降低(P0.01);HG与LG组的CHOP蛋白表达比差异无统计学意义。4、ATP及Ca~(2+)含量检测结果与SH组相比,NS组的ATP含量下降(P0.01);与NS组相比,LG组的ATP含量增高(P0.05),HG组的ATP含量也增高(P0.01);HG组与LG组ATP含量差异无统计学意义。与SH组相比,NS组的Ca~(2+)含量增加(P0.01);与NS组相比,HG组的Ca~(2+)含量降低(P0.05),LG组的钙含量与NS的对比没有差异;LG组与HG组比较,差异无统计学意义。5、MICU1蛋白含量表达结果与SH组相比,MICU1蛋白在NS组表达减低(P0.01);与NS组相比,MICU1蛋白在LG组表达增高(P0.05),MICU1蛋白在HG组表达增高(P0.05);HG组与LG组差异无统计学意义。【结论】心肺复苏前给予4-苯基丁酸可以通过抑制内质网应激相关凋亡途径,减轻内质网钙释放,拮抗钙超载,改善线粒体的能量代谢,减轻心脏骤停/心肺复苏诱导大鼠的全脑缺血再灌注损伤。
【图文】：
SH 组大鼠的 HE 染色可见脑神经元的细胞结构完整，染色均匀。间质致密，核大而圆。而 NS 组的神经元体积变小，核固缩或不规则，间质排列紊乱，组织水肿明显。在低倍镜下，与 SH 组相比，NS 组的 HE 染色结果可见明显的低密度区；与 NS 组相比，LG 组与 HG 组的低密度区面积明显减少，且 HG 组的低密度坏死区少于 LG 组。高倍镜下，与 SH 组相比，NS 组的 HE 染色可见核固缩，碎裂增多，核质分布不清晰，部分细胞水肿、坏死；与 NS 组相比，LG 和 HG 组的细胞核固缩、碎裂，细胞水肿、空泡的状态较少，，且 HG 组的细胞水肿、坏死的状态少于 LG 组。1、 HE 染色结果
TUNNEL染色图Fig1-2:ThestainingofTUNNEL图示：A：SH组B：NS组C：LG组D：HG组
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7
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