发热伴患者中和抗体检测和病毒糖蛋白表达及螨中新立克次体的发现

发布时间：2020-04-08 01:16

【摘要】：研究背景发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是一种以发热和血小板减少为主要临床特征的自然疫源性疾病,起初该病多被误诊为人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis)。2009年于学杰教授在SFTS患者血清中分离出一种新型布尼亚病毒,才确定该病属于新发病毒性疾病,并将该病毒命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus),简称 SFTSV。SFTSV属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒属(Phlebovirus),是分节段的单股负链RNA病毒,其基因组分为大(L)、中(M)、小(S)三个片段,分别编码不同的结构蛋白或非结构蛋白。其中M片段编码的是病毒的包膜糖蛋白前体,该前体在细胞内经蛋白酶水解作用形成Gn和Gc两个糖蛋白,并在内质网和高尔基体中加工后转移至病毒包膜和细胞膜上。蜱是SFTSV的传播媒介和自然宿主,起主要作用的是长角血蜱(Haemaphysalis longicornis),可以通过叮咬将病毒传播给人类,草地游离蜱的最小感染率(minimum infection rate,MIR)为0.2%～5.4%。另外,其他节肢动物如小盾纤恙螨(Leptotrombidlum sutellare)、毒棘厉螨(Echinolaelaps echidninus)和牛虻中也有检测到病毒核酸的个别报道,可能是其传播媒介。家养动物如羊、牛、狗、鸡、猪均可检测到SFTSV的抗体,但它们是否是SFTSV的扩大宿主尚需调查。SFTS患者的临床表现无特异性,会出现与流感相似症状,如发热、畏寒、乏力、厌食、恶心、眩晕等,实验室检查可见血小板减少、白细胞减少、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)升高等。SFTS病程一般分为潜伏期、发热期、多器官功能衰竭(MOF)期和恢复期。恢复期患者体内可检测到抗SFTSV特异性IgG抗体,作为感染SFTSV的依据。目前,我国已有23个省份报告SFTS病例,2011～2014年共报告SFTS病例5352例,主要集中在中东部地区。此外,日本、韩国和朝鲜也有SFTS的病例报道,病死率普遍较高。SFTS患者主要分布于山地丘陵地带,一般发生于4～10月,主要为老年人,绝大部分患者为农民。SFTSV亦可通过人-人进行传播,接触患者或死者的血液、分泌物或排泄物、气溶胶可能会发生感染。SFTSV的致病机制尚不完全清楚。现有研究表明,SFTSV感染会使免疫系统功能紊乱,各种细胞因子会产生不同程度的升高或降低,可能与疾病进展相关。目前,主要的动物模型有Ⅰ型干扰素受体敲除(IFNAR-/-)小鼠、新生小鼠和丝裂霉素处理的小鼠,这些小鼠感染SFTSV后可以产生不同程度的与人类相似的临床症状或死亡,应用动物模型可以更好地研究SFTSV在体内产生的病理改变。脾脏是公认的SFTSV感染最严重的器官。患者治疗方面目前只能以对症治疗和支持治疗为主,尚无治疗SFTS的特效药物和疫苗,因此疾病预防至关重要,最主要的预防措施是避免蜱虫叮咬,并加快疫苗的研制。人体感染病毒后,体内一般会产生不同水平的保护性免疫。中和抗体可以特异性结合入侵的病毒,保护人体不受病毒侵袭。检测恢复期患者体内中和抗体的水平,可以评价患者体内自身保护力的高低。预测中和抗体在患者体内维持的时间,可以有助于指导疫苗的接种程序。对于布尼亚病毒科病毒来说,糖蛋白在细胞融合、感染和免疫中起着至关重要的作用,一般可以作为中和抗原表位,刺激机体产生中和抗体。包膜糖蛋白的某些位点可以与细胞受体结合,介导吸附和膜融合过程。同时糖蛋白作为一种抗原可以刺激机体产生相应的特异性抗体,该抗体与糖蛋白抗原表位结合后,封闭了其与细胞受体结合的位点,糖蛋白就不能介导膜融合过程,从而不能感染细胞。因此,我们拟研究SFTSV糖蛋白Gn和Gc的功能特点,以定位SFTSV的中和抗原表位,这对于病毒致病机制的研究和疫苗的设计开发具有重要的意义。螨是一种体型微小的种类繁多的节肢动物,与人类和动物健康相关的螨包括恙螨、革螨、疥螨、尘螨、蠕形螨。其中,恙螨传播恙虫病,在我国具有尤其重要的医学意义。恙螨幼主要寄生宿主是啮齿类动物。恙虫病由恙虫病东方体引起,我国北方地区恙虫病东方体的主要由小盾纤恙螨传播,另外在小盾纤恙螨中也曾检出SFTSV核酸。本研究拟对啮齿类动物体表寄生的恙螨体内是否携带SFTSV和其他病原体进行检测,完善山东省恙螨携带病原体的情况。为了了解山东省啮齿动物寄生螨中的病原体携带情况,并明确恙螨是否是SFTSV和汉坦病毒的传播媒介,我们收集了捕获的啮齿动物耳部螨并进行了各种可疑病原体的PCR或RT-PCR检测。研究目的1.搜集SFTS患者信息,分析其流行病学特征。2.检测SFTS恢复期患者体内中和抗体水平,并分析其随时间变化情况,预测SFTS患者体内中和抗体维持时间。3.构建SFTSV糖蛋白Gn、Gc及其分段片段表达载体,并表达纯化目的蛋白。4.定位SFTSV的中和抗原表位,用于疫苗的设计和开发。5.了解山东省青岛市啮齿动物的种类及分布情况。6.明确山东省青岛市啮齿动物寄生螨中的病原体携带情况。研究方法1.从山东省淄博市沂源县疾病预防控制中心获取2011年和2012年SFTS患者信息,分别于2011年11月、2012年11月、2013年7月及2015年6月四次对接受随访调查的恢复期患者进行上门随访,采集患者恢复期血清,并填写调查问卷。运用双抗原夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测SFTS患者恢复期血清中IgG水平,进一步确诊SFTS。2.用vero细胞培养SFTSV,进行多次传代,选取产生明显空斑和细胞病变的病毒进行纯化和后续实验,建立重复性好的空斑形成单位法测定病毒滴度。运用空斑减少中和试验(Plaque reduction neutralization test,PRNT)检测患者血清中和抗体效价,以病毒在细胞中产生的空斑数减少50%的血清稀释度(PRNT50)表示。3.运用Microsoft Excel 2010软件进行数据的初步处理,用SPSS 19.0选用适当的统计方法进行数据的统计描述和分析,分析患者各项流行病学三间分布特征等,了解患者恢复期血清中和抗体效价的变化趋势。4.运用 R 3.3.1 软件通过广义估计方程(Generalized Estimating Equations,GEE)预测中和抗体维持时间,binom程序包用于计算中和抗体效价及95%CI,geepack程序包用于计算GEE模型预测中和抗体维持时间,msm程序包用于Delta法计算中和抗体维持时间的95%CI。5.将糖蛋白Gn分成长度相等的4个片段,Gc按照结构域的分界分成长度不同的6个片段,每两个相邻片段之间重合30个碱基,分别设计相应的引物,在各段目的基因上添加6×His或Strep Ⅱ标签,用PCR法扩增On、Gc全长及其分段片段目的基因,分别连入pCAGGS和pET32a(+)载体,构建各段目的基因真核和原核表达载体,并进行目的蛋白的真核和原核表达。用Western blot法检测各段目的蛋白的表达情况,用Ni-NTA柱纯化表达出来的各段目的蛋白,进行后续试验检测。6.于2015年10月在山东省青岛市黄岛区野外丘陵地带用捕鼠夹捕捉野鼠,将鼠耳剪下,用毛笔和镊子在显微镜下螨分离,按照体型特征大致分类后分装,同时解剖动物收集脾脏。7.提取螨和鼠脾的DNA和RNA,设计相关引物,运用]闶絇CR法或RT-PCR法扩增目的片段,回收目的条带后连接转化并测序,经序列比对确定螨的属种及螨携带病原体种类。8.应用SPSS 19.0软件进行数据的统计学处理。用χ2检验方法对不同种属的鼠的带螨率进行统计推断,P0.05表示差异具有统计学意义。应用Seqman和EditSeq软件对序列进行编辑和处理,将阳性基因序列分别进行系统发育分析。在GenBank中找出相应的立克次体序列,用ClustalX软件进行多序列比对,然后用Mega 7软件分别用Neighbor-joining(NJ)法和Maximum likelihood(ML)法进行系统发育分析,确定新立克次体与其他种类之间的进化关系。9.将立克次体阳性的螨的组织破碎液接种至vero细胞,培养7天后换液,提取脱落细胞的DNA,用]闶絇CR法检测其中有无立克次体。研究结果1.SFTS患者血清中和抗体检测及维持时间预测1.1在山东省淄博市沂源县2011年和2012年共收集33例确诊病例,死亡2例,6例患者拒绝采血和后续随访,因此共随访调查了发病的25位SFTS患者,其中2011年19例,2012年6例,分别进行信息和血清采集,四次随访共采集72份恢复期血清。25位患者在性别分布、年龄分布、职业分布、发病时间、临床症状、被蜱叮咬情况等流行病学特征方面与以往报道大体一致。1.2经双抗原夹心ELISA法检测,所有患者血清中均存在不同水平的IgG抗体,说明所有患者既往均感染过SFTSV。1.3经过SFTSV的多次在Vero细胞中传代培养,得到了能使Vero细胞稳定产生清晰空斑的病毒株,经空斑形成单位法检测病毒滴度为PFU=1.25×106 个/ml。1.4经过预实验和实验方法的优化,建立了空斑减少中和试验法检测中和抗体效价,所有患者血清中均存在不同水平的中和抗体,中和抗体效价PRNT50总体波动范围为1:5～1:640。1.5综合25位患者几年来的中和抗体水平来看,中和抗体效价平均几何滴度(Geometric mean titer,GMT)存在随时间推移逐渐下降的趋势,但是其中2位患者的第三份血清中和抗体效价高于第一次。1.6分别采用PRNT50=1:10和1:20两个效价作为中和抗体保护力阈值,经过广义估计方程计算,从整体来说,当PRNT50=1:20作为阈值时,中和抗体维持时间为6.7年(95%CI:5.1～8.3年);当PRNT50=1:10作为阈值时,中和抗体维持时间为9.2年(95%CI:7～11.4年)。女性较男性中和抗体维持时间大约长2年;按照中和抗体初始效价的不同分组计算,初始效价越高,中和抗体维持时间越长;按照年龄分组,不同年龄组间抗体效价随时间推移下降的趋势差异无统计学意义。2 SFTSV糖蛋白Gn、Gc及分段片段的表达及纯化2.1 改造 pCAGGS 载体,成功构建了 pCAGGS-Gn-strep、pCAGGS-Gc-strep、pCAGGS-Gn1-strep、pCAGGS-Gn2-strep、pCAGGS-Gn3-strep、pCAGGS-Gn4-strep、pCAGGS-Gc1-strep、pCAGGS-Gc2-strep、pCAGGS-Gc3-strep、pCAGGS-Gc4-strep、pCAGGS-Gc5-strep 和pCAGGS-Gc6-strep真核表达载体,转染293T细胞后除Gn和Gc全长蛋白在上清液中成功分泌表达外,分段片段均未成功表达。2.2 改造 pET32a(+)载体,成功构建了 pET32a-s-Gn、pET32a-s-Gc、pET32a-s-Gn1、pET32a-s-Gn2、pET32a-s-Gn3、pET32a-s-Gn4、pET32a-s-Gc 1、pETI32a-s-Gc2、pET32a-s-Gc3、pET32a-s-Gc4、pET32a-s-Gc5和pET32a-s-Gc6原核表达载体,并于16℃低温诱导成功表达了各段可溶性目的蛋白,但是目的蛋白未能成功纯化。3啮齿动物寄生螨中病原体检测3.1 2015年10月于山东省青岛市黄岛区室外共捕获32只啮齿动物,其中优势属种为黑线姬鼠(53.13%,17/32)和小家鼠(28.13%,9/32)。15只鼠耳上有螨寄生,带螨率为46.88%,不同种属的鼠带螨率没有统计学差异。15只鼠耳恙螨指数多少不一,携带数量范围为3～54只,共收集到319只小盾纤恙螨,恙螨指数为9.97。这些螨经提取DNA后,应用特异性引物进行线粒体DNA扩增,确定为小盾纤恙螨。3.2在螨的DNA中成功扩增出立克次体16S rRNA、gltA、ompB和17 kD相关序列,未成功扩增出ompA序列。螨中的该立克次体的最小感染率(MIR)为9/319,即2.8%。经过BLAST序列比对发现,用不同的基因引物扩增出的阳性立克次体序列分别对应不同的立克次体,每种基因片段同源性为96.5%～99.4%。3.3在螨的DNA或RNA中未扩增出恙虫病东方体、SFTSV和汉坦病毒相关序列。用PCR法在野鼠脾脏DNA中扩增ompB,16SrRNA,17kD,gltA和ompA 5个立克次体基因,结果均为阴性。3.4用扩增出的四段立克次体序列和四段序列拼接在一起的片段分别进行系统发育分析。ompB基因序列与Rickettsia sp.TwKM02的进化关系最为相近,位于进化树的同一分支,支持率为92%。16SrRNA基因序列与R.australis的进化关系最为相近,位于进化树的同一分支。17kD基因序列与R.akari的进化关系最为相近,位于进化树的同一分支,支持率为62%。gltA基因序列与R.australis的进化关系最为相近,位于进化树的同一分支。拼接片段序列与R.australis和R.akari进化关系最为接近,在同一分支。从进化关系来看,四个不同的基因分别与不同型别的立克次体位于同一进化分支,说明该立克次体为一种新型的立克次体,命名为Candidatus Rickettsia leptotrombidium。3.5细胞培养立克次,经过四次细胞换液,未检测出立克次体,说明没有成功分离到该新型立克次体。研究结论1.选育出了能产生清晰空斑的SFTSV毒株,建立了完善的PRNT检测SFTS患者血清中和抗体效价的方法。2.调查了沂源县25位SFTS患者,每位患者分别采集了 3-4年间恢复期血清,首次随访并检测了 SFTS患者长达4年血清中和抗体水平和变化趋势,有助于评估人体抗SFTSV的免疫能力。3.首次采用统计学方法预测了 SFTS患者体内中和抗体具有保护力的维持时间,为疫苗的免疫程序提供理论依据。中和抗体维持时间的长短在性别上有所差异,女性维持时间比男性长,提示免疫系统存在性别差异,在药物治疗和接种疫苗时应考虑性别对效果的影响。4.成功构建了 SFTSV糖蛋白Gn、Gc及其分段片段的真核和原核表达载体,表达了 SFTSV糖蛋白Gn、Gc及其分段片段的目的蛋白,各段目的蛋白的免疫原性是研制SFTSV亚单位疫苗的重要依据。5.成功在山东省青岛市野鼠寄生螨中检测出一种新型的立克次体,与R.australis和R.akari进化关系最为接近。鼠蜱中立克次体DNA阴性,说明鼠不能感染该立克次体或已过立克次体血症期。6.本次采集的寄生螨中未检测到恙虫病东方体、SFTSV和汉坦病毒的核酸。未能成功分离该新型立克次体。
【图文】：

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逑／邋／邋／邋／’邋ｙ逡逑图１－２山东省沂源县２０１１－２０１２年ＳＦＴＳ患者的年龄分布逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｇｅｏｆ邋ＳＦＴＳ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｉｎ邋２０１１邋ａｎｄ邋２０１２邋ｉｎ邋Ｙｉｙｕａｎ逡逑Ｃｏｕｎｔｙ，邋Ｓｈａｎｄｏｎｇ邋Ｐｒｏｖｉｎｃｅ逡逑３．邋ＳＦＴＳ发病时间分布逡逑从ＳＦＴＳ的发病时间来看，患者都于４？１０月发病，病例多集中于６？８月份，占逡逑所有病例数的８４％邋（图１－３）。这与ＳＦＴＳＶ的传播媒介——蜱虫的生活周期有逡逑很大的关系，当人们外出务农时，可能会遭到蜱虫的叮咬，，感染ＳＦＴＳＶ。逡逑３６逡逑

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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.8;R446.6

【参考文献】