硫化氢在缓解脂多糖诱导膈肌功能障碍中的作用
发布时间：2020-04-26 09:38
【摘要】：背景膈肌是主要的呼吸肌,呼吸肌功能的60%~80%均由膈肌完成,故其对维持生命呼吸至关重要。膈肌功能障碍是全球面临的重要临床问题,但其发病率和影响往往被忽视,且防治措施较少。研究证实,感染是危重病人膈肌功能障碍的主要危险因素,脓毒症可诱导膈肌功能障碍。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是大多数革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分之一,在多种不同动物模型中,LPS被广泛应用于诱导脓毒性膈肌功能障碍。硫化氢(hydrogen sulfide,H_2S)被认为是继NO及CO之后的第三种内源性气体信号分子,参与哺乳动物的多种生理和病理过程,具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、调节离子通道、保护心血管等作用,且在呼吸系统中起着重要的调节作用。目前,关于H_2S与膈肌功能障碍的研究鲜有报道。近期,首次发现H_2S对脓毒症诱导的膈肌功能障碍发挥了重要的细胞保护作用,并增加了脓毒症大鼠的生存率,但其具体机制有待进一步阐明。大鼠骨骼肌细胞系L6细胞被应用于膈肌的体外研究,在本课题组前期研究成果的基础上,我们采用LPS作用于L6细胞,探究外源性H_2S对LPS诱导的L6细胞损伤的影响;同时应用LPS构建脓毒症大鼠模型,研究H_2S对膈肌功能障碍及组织结构的影响,并探讨其相关机制。目的应用LPS处理大鼠骨骼肌细胞L6细胞,研究H_2S对LPS诱导的L6细胞的增殖、凋亡、抗炎、抗氧化等作用;同时应用LPS构建脓毒症大鼠模型,进一步研究H_2S对脓毒症诱导的膈肌功能障碍的影响,以期为临床治疗感染性膈肌功能障碍提供新的治疗策略。方法应用LPS刺激L6细胞,采用MTS、EdU、Tunel法分别检测对照组、LPS组和LPS+H_2S组L6细胞的增殖、凋亡水平;试剂盒检测各组细胞活性氧(reactie oxygen species,ROS)的生成及过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活力;蛋白免疫印迹法检测各组细胞凋亡信号通路、MAPK及NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平;ELISA试剂盒检测各组炎性因子的表达水平;构建脓毒症大鼠模型,检测H_2S对脓毒症大鼠膈肌力学指标及组织结构的影响。结果1.LPS诱导L6细胞后,细胞中及细胞上清中H_2S的水平明显降低,给予外源性H_2S显著提高了LPS诱导的L6细胞的活力及增殖能力。2.LPS诱导L6细胞后,H_2S可以通过MAPK信号通路降低ROS诱导的细胞凋亡。3.H_2S可以通过介导L6细胞中TLR-4/NF-κB信号通路来减轻LPS诱导的炎症反应。4.H_2S可以通过减轻脓毒症大鼠膈肌组织的炎症和凋亡从而改善膈肌功能和组织结构。结论H_2S可能参与了ROS/MAPK和TLR4/NF-κB信号转导通路,通过减轻细胞凋亡和炎症反应,从而改善由LPS诱导的大鼠膈肌功能障碍。
【图文】：
AB3.01% 。（B-E）250 ug/ml LPS 刺激 L6 细胞，24 h 后收集细胞，Western Blot 检测蛋白表达量。（F）50 ug/ml LPS 刺激 L6 细胞，24 h 后 ELISA 检测细胞内 H2S 的浓度。（G）250 ug/ml LPS 处理 L6胞，24 h 后试剂盒检测细胞上清中 H2S 的浓度。n=3，* P<0.05，** P <0.01 vs control group。4.2 H2S 能够提高 LPS 诱导后 L6 细胞的活力及细胞增殖能力为了验证上一步假设，我们给予 H2S 供体 NaHS 处理细胞，图 2-C 结果显示，与PS 组相比，H2S 供体对 LPS 所造成的细胞活力下降有逆转作用，而且此作用呈剂量依作用，NaHS 的浓度为 100 μM 时作用较为显著，因此在本课题中，我们选择了浓度 100 μM 的 NaHS 进行研究。以上结果表明 H2S 可能在 L6 细胞的生长中起重要作用，，是，我们采用 EdU 实验来检测细胞的增殖能力，倒置荧光显微镜下拍照观察并分析，果显示：LPS 组的细胞增殖能力明显下降，而 100 μM 的 NaHS 则逆转了该现象，且异具有统计学意义（图 2，A-B）。
4 实验结果胞核（高倍镜 10×20）。（C）细胞增殖率统计结果。n=6，* P<0.05，** P<0.01 vs control group；#P < 0.05，##P < 0.01 vs LPS group。4.3 H2S 能够降低 LPS 诱导的 L6 细胞的凋亡水平有研究显示，LPS 可以诱导细胞的凋亡。且鉴于以上实验现象，我们猜测细胞是否发生了凋亡。我们采用 Tunel 实验来检测各组细胞的凋亡水平，倒置荧光显微镜下拍照观察并分析，其现象与 EdU 实验趋势相反：LPS 组细胞的凋亡水平明显增加，而 LPS+H2S组的细胞凋亡水平则明显降低。我们推测 LPS 可能诱导 L6 细胞的凋亡，而 100 μM 的NaHS 对 LPS 诱导的凋亡有逆转作用。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7
本文编号：2641357
【图文】：
AB3.01% 。（B-E）250 ug/ml LPS 刺激 L6 细胞，24 h 后收集细胞，Western Blot 检测蛋白表达量。（F）50 ug/ml LPS 刺激 L6 细胞，24 h 后 ELISA 检测细胞内 H2S 的浓度。（G）250 ug/ml LPS 处理 L6胞，24 h 后试剂盒检测细胞上清中 H2S 的浓度。n=3，* P<0.05，** P <0.01 vs control group。4.2 H2S 能够提高 LPS 诱导后 L6 细胞的活力及细胞增殖能力为了验证上一步假设，我们给予 H2S 供体 NaHS 处理细胞，图 2-C 结果显示，与PS 组相比，H2S 供体对 LPS 所造成的细胞活力下降有逆转作用，而且此作用呈剂量依作用，NaHS 的浓度为 100 μM 时作用较为显著，因此在本课题中，我们选择了浓度 100 μM 的 NaHS 进行研究。以上结果表明 H2S 可能在 L6 细胞的生长中起重要作用，，是，我们采用 EdU 实验来检测细胞的增殖能力，倒置荧光显微镜下拍照观察并分析，果显示：LPS 组的细胞增殖能力明显下降，而 100 μM 的 NaHS 则逆转了该现象，且异具有统计学意义（图 2，A-B）。
4 实验结果胞核（高倍镜 10×20）。（C）细胞增殖率统计结果。n=6，* P<0.05，** P<0.01 vs control group；#P < 0.05，##P < 0.01 vs LPS group。4.3 H2S 能够降低 LPS 诱导的 L6 细胞的凋亡水平有研究显示，LPS 可以诱导细胞的凋亡。且鉴于以上实验现象，我们猜测细胞是否发生了凋亡。我们采用 Tunel 实验来检测各组细胞的凋亡水平，倒置荧光显微镜下拍照观察并分析，其现象与 EdU 实验趋势相反：LPS 组细胞的凋亡水平明显增加，而 LPS+H2S组的细胞凋亡水平则明显降低。我们推测 LPS 可能诱导 L6 细胞的凋亡，而 100 μM 的NaHS 对 LPS 诱导的凋亡有逆转作用。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 吴晓伟;李毅;王洪瑾;;硫化氢对烧伤大鼠肠道SIgA和T淋巴细胞亚群的影响[J];中华损伤与修复杂志(电子版);2013年04期
2 未培轩;李毅;王洪瑾;曾皓;;硫化氢对大鼠烧伤后炎症反应的影响[J];中华损伤与修复杂志(电子版);2012年01期
本文编号：2641357
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