【摘要】：背景与目的腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)作为肾脏替代治疗的方法之一,用于治疗终末期肾病患者。与血液透析(Hemodialysis,HD)相比,PD有利于对残余肾功能的保护,且其具有对血流动力学影响小,治疗费用相对较低,可居家操作等优势。而越来越多的证据表明:长期接触含高浓度葡萄糖的腹膜透析液(Peritoneal dialysis fluid,PDF)可导致PD患者慢性并发症的发生,例如增加心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)的发病率,以及导致残余肾功能(Residual renal function,RRF)丧失。长期PD可能会使腹腔发生明显的炎症反应,包括巨噬细胞和白细胞侵入腹膜。除了高糖腹透液的影响,炎性细胞因子的释放是腹膜结构和功能恶化的另一个主要驱动因素。腹膜炎以腹腔中性粒细胞浸润为特征,最终导致腹膜相关性腹膜炎的发生,使患者不得不退出腹膜透析治疗。研究证明IL-8是中性粒细胞分泌的一种强有力趋化细胞因子,之前有研究表明,IL-6和IL-8等炎症因子在腹膜炎患者的透析液中呈明显升高的趋势。当PD患者置管手术和患者发生腹膜炎的时候,IL-6浓度均会明显升高。然而,IL-8浓度只有在患者发生腹膜感染时才会升高。这些结果提示了透析液中IL-8浓度的测定可作为追踪PD患者发生腹膜炎的特异性指标。NF-κB作为一种常见转录因子,它可以介导多在不同的生物学过程中多种基因的表达,包括细胞生长、细胞存活,以及多种免疫反应和炎症反应。NF-κB也是多种主要炎症细胞因子(如TNF-α和IL-1)刺激信号转导的关键介质,从而参与炎症的效应期。EMT是由促纤维化和炎性刺激细胞因子触发的,人腹膜间皮细胞(Human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)中的EMT被认为是腹膜纤维化的早期阶段。预防PD患者的EMT可减轻腹膜周围的纤维化,从而保护腹膜间皮层。本研究的目的在于讨论,高糖环境下,人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)可以通过分泌IL-8,促进人腹膜间皮细胞发生EMT。用含葡萄糖的培养基培养PBMCs,收集培养后的上清,将其稀释10倍,继续培养HPMCs,采用Westernblot以及荧光定量PCR等方法检测与EMT相关的标志物。使用不同浓度以及不同时间的IL-8刺激HPMCs,观察EMT相关标记物的改变;以及IL-8对NF-κB信号通路的影响。将NF-κB特异性抑制剂PDTC加入至含IL-8的培养基,观察NF-κB信号通路被阻断之后,HPMCs的EMT过程是否受到抑制。由此我们可以得出结论,在高糖环境中,PBMCs分泌IL-8通过NF-κB信号通路促进HPMCs发生EMT,最终导致腹膜透析相关性腹膜炎的发生。方法1.收集普通外科手术相对正常的腹膜(如胆结石,阑尾炎等疾病)以及PD腹膜超滤衰竭拔管时的腹膜组织,利用免疫组化方法,使用巨噬细胞标记物CD68对腹膜组织进行染色。利用正置显微镜观察组织炎症细胞浸润并拍摄照片。2.用5.5mM正常糖浓度的RPMI-1640培养基作为对照组,和60mM高糖浓度的RPMI-1640培养PBMCs 24h后,收集上清液培养HPMCs,24h后收集总蛋白,采用Western Blot和荧光定量PCR方法检测EMT相关标志物的蛋白及mRNA水平。3.用60mM高糖培养基培养PBMCs24h后,以1:10稀释上清,并以此上清刺激HPMCs12h,24h,48h后,采用Western Blot和荧光定量PCR方法检测EMT相关标志物的蛋白及mRNA水平。4.用5.5mM正常糖浓度的RPMI-1640培养基作为对照组,和60mM高糖浓度的RPMI-1640培养PBMCs 24h后,提取RNA,以荧光定量PCR方法检测PBMCs中IL-8mRNA的表达水平。5.用正常培养基,浓度为10ng/ml和30ng/ml的IL-8分别刺激HPMCs24h,提取腹膜间皮细胞总蛋白,采用Western Blot方法检测EMT相关标志物的蛋白表达量,包括E-cadherin,Vimentin和α-SMA蛋白的表达水平。6.用30ng/mlIL-8分别刺激HPMCs12h,24h,48h,提取细胞蛋白,采用Western Blot方法检测EMT相关标志物的蛋白表达量。7.用正常培养基,浓度为10ng/ml和30ng/ml的IL-8分别刺激HPMCs24h,提取总蛋白,采用Westernblot方法,检测NF-κBP65蛋白的磷酸化水平。8.用30ng/ml IL-8分别刺激HPMCs 12h,24h,48h,提取细胞蛋白,采用Westernblot方法,检测NF-κBp65蛋白的磷酸化水平的改变。9.用正常培养基,30ng/mlIL-8,30ng/mlIL-8+1μM PDTC刺激HPMCs24h后,提取细胞总蛋白,采用Westernblot方法检测EMT标志物的蛋白水平的改变。结果1.使用CD68对腹膜透析超滤衰竭患者的腹膜组织进行染色,发现大量CD68阳性细胞浸润。2.以60mM的葡萄糖浓度刺激PBMC24h,收集上清液稀释后培养HPMCs,24h后收集总蛋白,Western Blot显示:与对照组及5.5mM葡萄糖浓度组相比,E-cadherin的蛋白和mRNA表达水平降低,α-SMA和Vimentin的蛋白及mRNA表达水平升高,差异有统计学意义(*#P0.05)。3.以60mM的葡萄糖浓度刺激PBMCs24小时后,收集上清液稀释后培养HPMCs12h,24h,48h,提取总蛋白,WesternBlot结果显示:随着刺激时间的延长,上皮表型E-cadherin的蛋白表达水平逐渐下调,间质表型蛋白α-SMA以及波形蛋白Vimentin的蛋白表达水平逐渐上调。差异有统计学意义(*P0.05)。4.分别用正常培养基和60mM葡萄糖培养基刺激PBMCs24h后,提取细胞RNA,采用荧光定量PCR方法检测得出:60mM的葡萄糖刺激PBMCs24h后,IL-8的mRNA表达呈现明显上调趋势,差异有统计学意义(*P0.05)。5.当IL-8的刺激浓度逐渐升高,E-cadherin的蛋白表达量呈现逐渐降低的趋势。间质表型蛋白α-SMA和波形蛋白Vimentin的蛋白表达水平呈逐渐上调的趋势。(*P0.05)。6.用30ng/ml IL-8分别刺激HPMCs 12h,24h,48h,提取细胞蛋白,Western Blot结果显示:随着IL-8刺激时间的延长,上皮表型蛋白E-cadherin的蛋白表达量逐渐下调;相反,间质表型蛋白α-SMA和Vimentin的蛋白表达水平呈逐渐上调的趋势(*P0.05)。7.随着IL-8刺激浓度的升高,NF-κBP65蛋白的磷酸化水平成逐渐上调的趋势(*P0.05)。8.随着30ng/mlIL-8刺激时间的延长,NF-κBP65蛋白的磷酸化水平逐渐升高(*P0.05)。9.阻断NF-κB信号通路后,Westernblot结果显示,抑制剂PDTC组的Ecadherin表达相较于IL-8刺激组,明显上调;而α-SMA和Vimentin的蛋白表达量下调(*P0.05)。结论1.高糖刺激PBMCs可间接诱导HPMCs发生EMT。2.PBMCs可以分泌IL-8,促进HPMCs的EMT过程。且随着IL-8浓度和时间的延长,EMT相关标志物的表达上调。3.IL-8可通过NF-κB信号通路诱导HPMCs发生EMT。
【图文】：
21正常 腹膜超滤衰竭图 1 腹膜组织中巨噬细胞标记蛋白 CD68 的表达糖刺激的 PBMCs 可诱导 HPMCs 发生 EMT高糖环境中 PBMCs 对 HPMCs EMT 相关蛋白表达的影响分别以 5.5mM 葡萄糖浓度的培养基和 60mM 葡萄糖浓度的培养基刺激C24h，收集上清液培养 HPMCs，24h 后收集总蛋白，采用 Western B测细胞的蛋白表达量，其结果提示：与正常对照组和 5.5mM 正常葡萄激组相比，60mM 葡萄糖刺激组的上皮表型 E-cadherin 蛋白表达水平明，间质表型 α-SMA 以及波形蛋白 Vimentin 的蛋白表达水平明显升高,
图 2 高糖环境中 PBMCs 对 HPMCs EMT 蛋白标志物表达的影响A .E-cadherin，Vimentin，α-SMA 在细胞中的表达情况B. E-cadherin，Vimentin，α-SMA 的相对表达水平（*#P<0.05）2.2 高糖环境中 PBMCs 对 HPMCs EMT 标志物 mRNA 表达的影响以 5.5mM 葡萄糖培养基和 60mM 葡萄糖浓度培养基刺激 PBMC24h，收集上清液培养 HPMCs，24h 后提取细胞 RNA，，荧光定量 PCR 结果显示：与正常对照组及 5.5mM 葡萄糖浓度组相比，60mM 葡萄糖刺激组的上皮表型 E-cadherin的 mRNA 表达降低（图 3A），间质表型蛋白 α-SMA 以及波形蛋白 Vimentin 的mRNA 表达升高,差异具有统计学意义。n=3,*#P<0.05（图 3B、3C）。而正常对照组与 5.5mM 葡萄糖浓度组的差异并无统计学意义。n=3, *#P>0.05。APDHPDHPDH
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R692.5
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 邵维斌;路萍;夏春英;李忻;荀康;;晚期糖基化终产物对体外培养人腹膜间皮细胞上皮-间叶转化的影响[J];临床医药文献电子杂志;2017年32期
2 李志明;何学红;赵钢;;三七总皂苷对腹膜间皮细胞表达MCP-1的影响[J];辽宁中医杂志;2012年06期
3 洪富源;孙芳;刘军;姚建;黄一新;;蛋白激酶C在晚期糖基化终产物促进人腹膜间皮细胞分泌纤维连接蛋白中的作用[J];中国应用生理学杂志;2012年04期
4 何劲松;印荻;朱桂松;;川芎嗪对高糖诱导后人腹膜间皮细胞血管内皮生长因子表达的影响[J];中国生化药物杂志;2008年06期
5 蒋春明;张苗;孙t$;;葛根素对体外培养人腹膜间皮细胞保护作用的研究[J];东南大学学报(医学版);2007年03期
6 刘虹,彭佑铭,刘伏友;过氧化物增生体激活受体-γ激动剂抑制腹膜间皮细胞转化生长因子-β_1的表达[J];肾脏病与透析肾移植杂志;2005年02期
7 殷莉波;赵文秀;尹震宇;王效民;;人腹膜间皮细胞的改良分离及其鉴定[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年27期
8 李向阳;汪电雷;;灯盏花素对腹膜间皮细胞生长和增殖的影响分析[J];中国医药指南;2011年26期
9 钱敏;何劲松;印荻;朱桂松;;辛伐他汀对高糖诱导后人腹膜间皮细胞血管内皮生长因子表达的影响[J];中国生化药物杂志;2009年03期
10 臧燕,侯凡凡,张训,杨满球;表皮生长因子对腹膜间皮细胞增殖的影响[J];中华内科杂志;1996年02期
相关会议论文 前10条
1 洪富源;孙芳;刘军;姚建;;二羰基化合物对人腹膜间皮细胞VEGF表达的影响[A];“中华医学会肾脏病学分会2004年年会”暨“第二届全国中青年肾脏病学术会议”论文汇编[C];2004年
2 贾海燕;樊怡;马健飞;张玉侠;冯江敏;王力宁;;高糖对腹膜间皮细胞醛糖还原酶活性的影响[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年
3 黄一新;;高糖、炎症因子和黄芪对人腹膜间皮细胞增殖的影响[A];2007年浙沪两地肾脏病学术年会资料汇编[C];2007年
4 姜书宁;赵久阳;张怡玲;;干扰素-α对高糖环境下腹膜间皮细胞合成细胞外基质的影响[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年
5 刘映虹;刘伏友;彭佑铭;刘虹;李茂玉;张浩;;高浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞细胞骨架蛋白的影响[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年
6 韩捷;马健飞;樊怡;贾海燕;马黎;张玉侠;冯江敏;王力宁;;脂多糖、高糖对人腹膜间皮细胞葡萄糖转运蛋白1表达的影响[A];中华医学会肾脏病学分会2006年学术年会论文集[C];2006年
7 郝世军;李云生;林华志;王怡倩;王文龙;程勇军;柯颖杰;戴再友;;银杏达莫对腹膜间皮细胞活性影响研究[A];2012年浙江省肾脏病学术年会论文集[C];2012年
8 刘映红;黄昭;刘伏友;彭佑铭;;胰岛素对人腹膜间皮细胞增殖、损伤及凋亡的影响[A];中华医院管理学会血液净化中心管理分会2004年会论文汇编[C];2004年
9 李龙凯;;核心岩藻糖基化修饰对高糖诱导的大鼠腹膜间皮细胞间充质转分化的影响[A];中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会2015年学术年会资料汇编[C];2015年
10 樊怡;马健飞;李志明;丁红;张靖华;;蛋白激酶C对腹膜间皮细胞己糖激酶活性的特异性调节[A];“中华医学会肾脏病学分会2004年年会”暨“第二届全国中青年肾脏病学术会议”论文汇编[C];2004年
相关博士学位论文 前10条
1 樊怡;高糖通过p38MAPK和ERK1/2通路诱导腹膜间皮细胞己糖激酶表达的实验研究[D];中国医科大学;2006年
2 洪富源;甲基乙二醛、晚期糖基化产物对人腹膜间皮细胞生物学作用的体外研究[D];复旦大学;2006年
3 李志明;核因子κB信号途径调控腹膜间皮细胞表达MCP-1的实验研究[D];中国医科大学;2007年
4 张露;黄芪甲苷干预腹膜间皮细胞表型转化的分子机制研究[D];南京中医药大学;2017年
5 房艳辉;低密度脂蛋白对高糖背景下人腹膜间皮细胞转分化和细胞外基质蓄积的影响及其机制探讨[D];北京协和医学院;2011年
6 彭翔;PI3K/Akt信号通路在腹膜间皮细胞转分化中的作用及机制研究[D];中南大学;2010年
7 张柯;miRNA589在TGF-β_1诱导人腹膜间皮细胞上皮—间充质转分化的作用及分子机制[D];中南大学;2010年
8 周循;microRNA-129-5p在人腹膜间皮细胞转分化中的作用及分子机制[D];中南大学;2010年
9 李勰家;慢病毒介导的miRNA-302c对腹膜间皮细胞EMT的干预作用及机制研究[D];中南大学;2012年
10 董U
本文编号：2647710
