右美托咪定调控miR-146a对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用及机制

发布时间：2020-05-04 11:13

【摘要】：研究背景脓毒症(Sepsis)是临床常见危重症之一,是由于宿主对感染的反应不受控制而导致的一种危及生命的器官功能障碍。脓毒症的原因众多,但在外科手术后、多发伤及严重烧伤等导致的严重疾患中最为常见。脓毒症发生时,可造成多个器官的急性损伤,而肺脏往往最先受累。脓毒症所致急性肺损伤(Acute lung injury,ALI),在患病人群中有很高的死亡率,也会对幸存者的远期生活质量产生严重不利影响。近年来,抗感染及器官功能支持治疗技术有了长足发展,对脓毒症相关急性肺损伤的的流行病学和发病机制的认识方面也取得了一定进展,但是临床研究表明,目前的治疗策略在降低急性肺损伤患者死亡率方面没有显著效果。因此,迫切需要更多的基础研究来探索急性肺损伤发生发展的分子机制,从而得到更多有效的治疗方法。目前的研究认为,急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征发生的根本原因是感染、创伤后的全身炎症反应。而在炎症反应过程中,NF-κB(核因子κB)信号通路的激活及调控起到关键性作用。NF-κB蛋白最早由David Baltimore发现,该蛋白家族可以选择性的结合在B细胞κ-轻链增强子上调控许多基因的表达。NF-κB信号通路是由细胞外的刺激引起的,NF-κB是对有害细胞刺激的第一反应者。已知的NF-κB通路激活因子有很多,包括脂多糖、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、IL-1β(白介素1β)、IL-6(白介素6)、COX2(环氧合酶2)、趋化因子、粘附分子、集落刺激因子等,它们与细胞膜上的受体结合,开启了一连串下游的反应。受体蛋白接受刺激后先活化IκB激酶(IKK),IKK将细胞内NF-κB·IκB复合物的IκB亚基调节位点的丝氨酸磷酸化,使得IκB亚基被泛素化修饰,进而被蛋白酶降解,从而释放NF-κB二聚体。游离的NF-κB会进入细胞核,与有NF-κB结合位点的基因结合启动转录进程,进而又产生大量的促炎因子特别是TNF-α、IL-1β、IL-6,它们再次激活NF-κB信号通路,导致炎症的级联放大,从而导致肺损伤的不断恶化。miRNAs是小的、非编码的单链RNA分子,通过降低mRNA稳定性或抑制mRNA翻译参与基因表达的调节,在多种生物过程如发育、分化和内稳态中起关键调节作用。近几年,多项研究证明microRNAs(miRNAs)是全身炎症的有效调节因子。其中,miRNA-146a是首个被证实在免疫及炎症反应中发挥调节作用的miRNA,在免疫炎症反应中具有反向调控能力,它的正常表达对防控炎症的级联放大有关键作用,在调控固有免疫和适应性免疫细胞分化及功能中发挥重要作用。研究指出,miR-146a在LPS处理的大鼠肺中表达较高,但miR-146a模拟剂治疗意外地抑制了鼠肺泡巨噬细胞LPS介导的TNF-α、IL-6和IL-1β的生成,其机制可能是通过抑制NF-κB活化的介质白介素-1受体相关激酶1(IRAK-1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)实现的。IRAK1作为受体蛋白,广泛分布于各种细胞,参与TLR等信号传导通路,对炎症反应具有重要的调节作用;而TRAF6在IL-1和LPS引起的NF-κB活化过程中是必不可少的。IRAK1和TRAF6是LPS/TLR4/NF-KB信号通路中的两个关键接头蛋白,能够促进TNF-α、IL-1β等炎症细胞因子所促发的炎症反应,多项研究指出miR-146a可以直接靶向IRAK1和TRAF6并对其负向调控。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一种高度选择性的α2-肾上腺素能受体激动剂,因其具有镇静、镇痛及抗交感作用而广泛应用于重症监护病房的镇静和临床麻醉。目前,多项研究为Dex在各种炎症相关疾病包括脓毒症中的有益作用提供了有力的证据,并指出Dex具有减轻急性肺损伤的作用,从而引起了人们的广泛关注。Meng等人的研究指出,Dex可能通过高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein,HMGB1)介导的 Toll 样受体 4(TLR4)/NF-κB 和PI3K/Akt/mTOR途径对脂多糖(LPS)诱导的大鼠急性肺损伤发挥保护作用。Xu等人通过LPS诱导建立小鼠脓毒症肺损伤模型,指出Dex可能是通过抑制MAPK通路减轻急性肺损伤。Jiang等人在人肺泡上皮细胞A549的研究表明,Dex预处理对ALI具有体外保护作用,可能的机制是抑制细胞死亡和提高细胞抗氧化能力。虽然做了诸多探索,Dex减轻急性肺损伤的机制目前仍不明确,有待进一步深入研究。最近的研究指出,Dex可以通过调控microRNA的表达而发挥其器官保护作用。Wang等人的研究表明,右美托咪定通过调控miR-520a-3p抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移,促进细胞凋亡;Li等人通过建立大鼠模型,研究指出Dex可通过调控miR-146a水平抑制细胞凋亡而减轻COPD;Paeschke等人通过建立LPS诱导的大鼠中枢神经炎症模型,发现Dex抑制了 LPS诱导的大鼠脑内多种miRNA的表达而发挥脑保护作用。基于以上研究,我们提出假设,右美托咪定是否通过调控miR-146a进而影响NF-κB信号通路中的两种关键蛋白IRAK1和TRAF6的表达而对脓毒症ALI发挥保护作用?本研究利用腹腔注射脂多糖(LPS)的方法建立小鼠脓毒症相关急性肺损伤模型,通过观察和测定各组别小鼠肺损伤程度、肺组织病理学、炎症细胞因子TNF-α、IL-1β的变化、NF-κB p65向核转运和I-κB磷酸化程度、miR-146a表达、IRAK1和TRAF6分子及基因水平的变化,探讨右美托咪定对脓毒症相关急性肺损伤的保护作用及其机制,旨在为临床上急性肺损伤的治疗提供新的思路和理论依据。目的1.明确右美托咪定对脓毒症相关急性肺损伤的保护作用;2.探讨右美托咪定对脓毒症相关急性肺损伤保护作用的可能机制。方法54只健康雄性BALB/c小鼠,体重21±2g,购自南京卡德文思生物技术有限公司,饲养于21-25℃清洁级动物房,自由进食、饮水,维持12小时的光暗循环。实验前,小鼠适应性饲养至少一周。为了初步探讨右美托咪定减轻脓毒症相关急性肺损伤的作用和机制,将24只实验小鼠,随机分为4组,每组6只,分别为对照组(Control组)、LPS组、Dex+LPS 组、DXM(Dexamethasone,地塞米松)+LPS 组。Control 组:腹腔注射相应容量生理盐水;LPS组:腹腔注射LPS(10mg/kg)建立脓毒症急性肺损伤模型;Dex+LPS组:在应用LPS前15分钟腹腔注射Dex(40μg/kg);DXM+LPS组:在应用LPS前15分钟腹腔注射DXM(50μg/kg)作为减轻急性肺损伤的阳性对照。为了进一步验证右美托咪定是否通过调控miR-146a减轻急性肺损伤,在实验中引入miR-146a的特异性拮抗剂miR146a-ant,将30只小鼠,参照以上方法随机分为5组,每组6只,分别为Control组、LPS组、Dex+LPS组、Dex+LPS+miR146a-ant 组和 LPS+miR146a-ant 组,其中 Dex+LPS+miR146a-ant组在应用LPS和Dex前15分钟腹腔注射miR146a-ant,LPS+miR146a-ant组在应用LPS前15分钟腹腔注射miR146a-ant。实验小鼠经过处理后放回笼中,自由进食进水,6小时后收集肺组织、支气管肺泡灌洗液(BALF)及血清标本。剪取部分肺组织测定肺湿干比(W/D),反映肺水含量,评价肺组织水肿程度;二喹琳甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)法测定BALF中的蛋白含量;检测BALF中炎症细胞数目;HE染色光镜下评价肺组织病理学变化;酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测肺组织及血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的表达;实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time-PCR,qPCR)测定肺组织 miRNA-146a、IRAK1 mRNA、TRAF6 mRNA 表达水平的变化;Western Blot 检测 IRAK1、TRAF6、NF-κBp65、p-IκB、IκB 表达。结果1.小鼠脓毒症急性肺损伤模型建立成功LPS组采用腹腔注射LPS(10mg/kg)建立脓毒症急性肺损伤模型。LPS组小鼠表现为寒战、毛发竖立、呼吸窘迫、活动明显减少、口鼻分泌物增多、腹泻。与对照组比较,LPS组肺组织有明显的病理改变,包括肺泡壁增厚、肺组织破坏和炎细胞浸润,肺损伤评分显著升高,W/D显著升高(P0.01),BALF蛋白含量及炎症细胞数量均明显升高(P0.01)。2.右美托咪定减轻LPS诱导的脓毒症小鼠肺组织损伤我们观察对比了各组肺组织的病理学改变、反映肺水肿程度的指标肺W/D、反映肺毛细血管通透性指标BALF中的蛋白含量及炎症细胞数量。肺组织的病理学改变:与对照组比较,LPS组肺组织有明显的病理改变,包括肺泡壁增厚、肺组织破坏和炎细胞浸润,肺损伤评分显著升高(P0.01);与LPS组比较,Dex+LPS组和DXM+LPS组肺组织病理改变明显减轻,肺损伤评分明显降低(P0.01)。肺湿干比(W/D):与对照组比较,LPS组W/D明显升高,两组间差异有显著统计学意义(P0.01);与LPS组比较,Dex+LPS组和DXM+LPS组W/D明显降低,两组间差异有显著统计学意义(P0.01)。BALF中的蛋白含量:与对照组比较,LPS组BALF中的蛋白含量明显升高,两组间有显著差异(P0.01);与LPS组比较,Dex+LPS组和DXM+LPS组BALF中的蛋白含量明显降低,两组间差异有统计学意义(P0.01)。BALF中的炎症细胞数量:与对照组比较,LPS组BALF中的炎症细胞明显增多,两组间有统计学差异(P0.01);与LPS组比较,Dex+LPS组BALF炎症细胞数量明显减少(P0.01)。3.右美托咪定显著抑制急性肺损伤相关炎症因子分泌ELISA检测肺组织及血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的表达,结果显示,与对照组比较,LPS组肺组织及血清中IL-1β、TNF-α表达显著增加,两组间有统计学差异(P0.01);与LPS组比较,Dex+LPS组和DXM+LPS组肺组织及血清中IL-1β、TNF-α表达显著减少(P0.01)。结果表明,Dex明显减少ALI相关的促炎细胞因子表达,抑制炎症反应,提示Dex可以通过抑制炎症因子的产生而减轻肺损伤。4.右美托咪定预处理抑制了 NF-κB的活化Western Blot检测NF-KB p65核转运和IκB磷酸化的水平,结果示:与LPS组比较,Dex+LPS组和DXM+LPS组中NF-κB p65向核转运和肺IκB磷酸化显著减少(P0.01);以上结果表明,Dex减轻ALI的作用与抑制NF-κB的活化有关。5.右美托咪定治疗降低NF-κB信号通路上游接头蛋白IRAK1、TRAF6的水平我们分别从基因和蛋白水平检测了 IRAK1、TRAF6的表达,与对照组相比,LPS 组 IRAK1、TRAF6 蛋白和 IRAK1 mRNA、TRAF6 mRNA 水平显著增加(P0.01);与 LPS 组比较,Dex+LPS 组和 DXM+LPS 组中 IRAK1、TRAF6 蛋白水平显著减少(P0.01)。以上结果表明,Dex通过降低NF-κB信号通路上游接头蛋白IRAK1、TRAF6的表达发挥肺保护作用。6.右美托咪定治疗明显上调miR-146a的表达为了进一步揭示Dex减轻ALI的机制,我们检测了各组小鼠肺组织miR-146a的表达水平。结果显示,与对照组相比,LPS组miR-146a的表达水平升高(P0.01)与LPS组比较,Dex+LPS组中miR-146a的表达水平显著升高(P0.01)。上面的结果表明,右美托咪定的肺保护作用可能是通过上调miR-146a的表达来实现的。7.miR146a-ant(miR-146a拮抗剂)明显削弱Dex对脓毒症相关ALI的保护作用7.1 miR-146a在各组的表达与对照组比较,LPS组miR-146a明显升高(P0.01);与LPS组比较,Dex+LPS组 miR-146a 显著升高(P0.01);与 Dex+LPS 组比较,miR146a-ant+Dex+LPS组miR-146a水平明显降低,两组间差异有显著统计学意义(P0.01);与LPS组比较,miR146a-ant+LPS 组 miR-146a 水平明显降低(P0.01)。7.2 IRAK1、TRAF6蛋白水平变化与对照组比较,LPS组IRAK1、TRAF6蛋白水平明显升高(P0.01);与LPS 组比较,Dex+LPS 组 IRAK1、TRAF6 蛋白显著降低(P0.01);与 Dex+LPS组比较,miR146a-ant+Dex+LPS组IRAK1、TRAF6蛋白水平明显升高,两组间差异有显著统计学意义(P0.01);与LPS组比较,miR146a-ant+LPS组IRAK1、TRAF6水平明显升高(P0.01)。7.3 NF-κB p65核转运和IκB磷酸化水平变化注射LPS后,小鼠肺组织NF-κB p65向核转运和IκB磷酸化显著增强(P0.01);与LPS组比较,Dex+LPS组中NF-κB p65向核转运和肺IκB磷酸化显著减少(P0.01);与Dex+LPS组比较,miR146a-ant+Dex+LPS组肺组织中NF-κB p65的激活和IκB磷酸化则明显增加(P0.01);与LPS组比较,miR146a-ant+LPS组NF-κB p65活性及IκB磷酸化明显增强。7.4肺组织及血清中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β的表达变化与对照组比较,LPS组肺组织及血清中IL-1β、TNF-α表达显著增加,两组间有统计学差异(P0.01);与LPS组比较,Dex+LPS组肺组织及血清中IL-1β、TNF-α 表达显著减少(P0.01);与 Dex+LPS 组比较,miR146a-ant+Dex+LPS组 IL-1β、TNF-α水平明显增加(P0.01);与 LPS 组比较,miR146a-ant+LPS组肺组织及血清中IL-1β、TNF-α表达增多(P0.01,P0.05)。7.5肺组织病理学与W/D变化:与对照组比较,LPS组肺组织肺泡壁增厚、肺组织破坏和炎细胞浸润,肺损伤评分及W/D均显著升高(P0.01);与LPS组比较,Dex+LPS组肺组织病理改变明显减弱,肺损伤评分及W/D明显降低(P0.01);与Dex+LPS组比较,miR146a-ant+Dex+LPS组肺组织病理学损伤显著,肺损伤评分及W/D均显著升高(P0.01);与LPS组比较,miR146a-ant+LPS组肺组织病理学损伤显著,肺损伤评分及W/D均显著升高(P0.01)。以上结果表明,Dex通过明显上调miR-146a来发挥肺保护作用,而这种作用被其拮抗剂miR146a-ant所明显削弱。结论1.本研究通过建立小鼠LPS诱导的急性肺损伤模型可以成功模拟脓毒症相关急性肺损伤的病理过程;2.右美托咪定能够通过下调IRAK1、TRAF6的水平、抑制NF-κB的活化和肺组织及血清促炎细胞因子TNF-α、IL-6的表达、改善肺组织病理损伤来实现肺保护作用,且IRAK1、TRAF6蛋白水平的变化依赖于miR-146a的表达上调;3.右美托咪定预处理具有脓毒症相关急性肺损伤的保护作用,这种保护作用是通过调控miR-146a水平实现的,提示右美托咪定可以作为肺保护的靶点作用药物,为临床治疗提供新思路。
【图文】：

肺损伤,对照组

图１．２．１肺组织病理学改变（放大１００倍）与肺损伤评分。和对照组比较＊＊Ｐ＜０．０１；逡逑和ＬＰＳ组比较＃％＜０．０１，逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２．１邋Ｌｕｎｇ邋ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ（ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋１００Ｘ）邋ａｎｄ邋ｌｕｎｇ邋ｉｎｊｕｒｙ逡逑ｓｃｏｒｅｓ．＊＊Ｐ＜０．０１邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ逦0ｉ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＬＰＳ邋ｇｒｏｕｐ逡逑

肺损伤,对照组,蛋白含量,炎症

逦■■逡逑＿画恤逡逑图１．２．１肺组织病理学改变（放大１００倍）与肺损伤评分。和对照组比较＊＊Ｐ＜０．０１；逡逑和ＬＰＳ组比较＃％＜０．０１，逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２．１邋Ｌｕｎｇ邋ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ（ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋１００Ｘ）邋ａｎｄ邋ｌｕｎｇ邋ｉｎｊｕｒｙ逡逑ｓｃｏｒｅｓ．＊＊Ｐ＜０．０１邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ逦0ｉ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＬＰＳ邋ｇｒｏｕｐ逡逑８逦。勹逦“逦８ｉ邋辛逡逑Ｉ６，邋ｎ逦『Ｈ邋．邋ｉ逦ｌ逦Ｈ邋－．逡逑１邋Ｊｎｉｉｌ逦＇ｊｎｌｉｌ逦丨邋Ｉｄ邋１８邋ｉ逡逑图邋１．２．２逦图邋１．２．３逦图邋１．２．４逡逑各组肺湿干比（Ｗ／Ｄ）（图１．２．２）、ＢＡＬＦ中的蛋白含量（图１．２．３）和ＢＡＬＦ中的炎症细逡逑胞数量（图１．２．４）。和对照组比较＊＊尸＜０．０１；和ＬＰＳ组比较＃＃Ｐ＜０．０１，ＡＡＰ＜０．０１逡逑Ｌｕｎｇ邋ｗｅｔ邋ｔｏ邋ｄｒｙ邋ｒａｔｉｏ邋（Ｗ／Ｄ）邋ｉｎ邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋（ｆｉｇｕｒｅ邋１．２．２），邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｉｎ邋ＢＡＬＦ邋（ｆｉｇｕｒｅ邋１．２．３），，逡逑ａｎｄ邋ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｃｅｌｌ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｉｎ邋ＢＡＬＦ邋（ｆｉｇｕｒｅ邋１．２．４）．＊＊／＊＜０．０１邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐ邋＾ＰＯ．ＯＬＭｐｃＯ．0ｉ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＬＰＳ邋ｇｒｏｕｐ逡逑４７逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R459.7

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