肝X受体β在慢性炎性痛中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-04 11:43

【摘要】：【研究背景和目的】慢性痛被定义为在多种病理条件下,由持续的组织炎症或神经损伤引起的神经表观遗传学疾病,并伴有从基因调节到突触功能障碍和情绪障碍等持久的、多方面的适应不良反应。炎症、组织或神经损伤导致的脊髓背根神经节、脊髓背角和疼痛相关脑区感觉神经元基因表达的改变,被认为参与慢性痛的发生发展。这些变化是如何发生的?人们一直在努力寻找影响这些基因表达的调控机制。表观遗传学修饰,包括DNA甲基化、组蛋白修饰和小分子核糖核酸,被广泛证实可有效地调控基因的表达。表观遗传学改变可能会持续数年甚至数代,参与调控慢性痛条件下的疼痛超敏反应。中枢敏化在慢性痛的发生发展中发挥重要作用,它与躯体感觉皮质、岛叶皮质和前扣带回皮层(Anterior cingulate cortex,ACC)的分布结构群的激活有关。ACC在疼痛研究中受到越来越多的关注,已证实ACC在疼痛调节、学习、记忆和注意力等方面发挥着关键作用。多种机制影响慢性痛的中枢敏化过程。其中,神经炎症信号作用于中枢神经系统(Central nervous system,CNS),引起包括神经递质传递、神经内分泌功能和神经可塑性的变化,导致大脑痛觉敏化,成为慢性痛发生发展至关重要的因素。我们课题组之前的研究也证实,小鼠ACC区突触兴奋性神经递质释放增加导致慢性炎性痛的发生。另有研究表明,中枢敏化与CNS中处理痛觉信号的细胞内基因异常的表达有关。肝X受体(Liver X receptors,LXRs)是核受体超家族的一种转录因子,包括LXRα(即NR1h3)和LXRβ(即NR1h2),具有调节细胞和全身胆固醇稳态的重要功能,其在CNS中的重要作用日益受到关注。LXRα主要表达在脂类代谢相关的器官,而LXRβ广泛表达于全身各系统,并在免疫系统和CNS中发挥重要作用。敲除LXRα基本不引起小鼠的发育缺陷,而敲除LXRβ则导致大脑皮质构筑紊乱、黑质多巴胺能神经元丢失、焦虑等行为异常。此外,LXRβ在脊髓中亦有表达,雄性LXRβ~(-/-)小鼠表现出成熟运动神经元退化,而激动剂T0901317通过激活LXRβ发挥脊髓保护的作用。GW3965是另一种人工合成的LXRs激动剂,可同时激活LXRα和LXRβ亚型,易透过血脑屏障发挥作用。LXRs的激动剂T0901317或者GW3965可减轻神经病理性痛的机械痛觉过敏,延迟肥胖引起的痛觉过敏。然而,LXRs在慢性痛中的作用在很大程度上仍是未知的。本研究拟建立完全弗氏佐剂(Complete Freund’s adjuvant,CFA)诱导的慢性炎性痛(Chronic inflammatory pain,CIP)小鼠模型,综合采用动物行为学、电生理学、分子生物学和表观遗传学等实验手段,开展以下研究:(1)明确LXRs功能失调是否参与CIP的发病;(2)探讨激活LXRs在CIP中发挥镇痛效应的可能机制;(3)确定GW3965发挥镇痛效应的LXRs受体途径;(4)阐明CIP中调控ACC区LXRβ表达和功能异常的表观遗传学机制。通过以上研究,旨在评价LXRβ作为治疗慢性痛药物新靶点的可能性,为慢性痛的临床研究和药物开发提供了新的研究思路以及理论依据。【研究方法】1.激活LXRs在改善CIP小鼠痛行为中的作用1.1检测LXRs在痛觉高度相关脑区——ACC区的表达情况免疫荧光染色检测LXRs,包括LXRα和LXRβ,在ACC区的表达及细胞特异性。将LXRβ分别与神经元标记物β-tubulin III、星形胶质细胞标记物GFAP、小胶质细胞标记物Iba-1进行共标,以确定LXRβ在ACC区的细胞表达模式;将LXRβ分别与兴奋性神经元标记物CAMK IIa、抑制性神经元标记物GAD67进行共标,以确定LXRβ在ACC表达的神经元类型。1.2 CIP小鼠ACC区LXRs表达的变化建立小鼠足底皮下注射CFA(CFA:0.9%生理盐水=1:1,共10μl)诱导的CIP小鼠模型。CFA注射后的1、3、5、7和14 d,Von Frey和热刺痛仪分别检测小鼠的机械痛和热痛行为。免疫组化染色和Western blot检测CIP模型小鼠不同时间点ACC区LXRα和LXRβ表达水平的变化。1.3 LXRs的激动剂GW3965对CIP小鼠痛行为的影响建立CIP小鼠模型,给予LXRs的激动剂GW3965预处理和后治疗,评价GW3965对CIP小鼠痛行为的影响。1.4 GW3965对CIP小鼠ACC区LXRs表达及功能的影响给予小鼠GW3965预处理后建立CIP小鼠模型,Western blot检测GW3965对LXRs表达的影响;酶联免疫吸附(ELISA)检测GW3965治疗前后CIP小鼠ACC和血清中LXRs的靶基因ATP结合盒转运子A1(ATP-binding cassette transporter 1,ABCA1)、载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)的表达变化,以确定GW3965对LXRs功能的影响。1.5慢病毒下调ACC区LXRs的表达对小鼠痛行为的影响设计并包装LXRα、LXRβ的慢病毒干扰表达载体(short hairpin RNA for LXRα,shLXRα;short hairpin RNA for LXRβ,shLXRβ),以及它们的阴性对照(short hairpin RNA for negative control,shNC)。利用脑立体定向和微量注射系统,分别向小鼠双侧ACC区定量注射慢病毒shLXRα、shLXRβ或shNC;2周后,Western blot检验shLXRα、shLXRβ下调ACC区LXRα、LXRβ蛋白表达的效果。Von Frey和热刺痛仪检测下调ACC区LXRα、LXRβ蛋白表达后,小鼠机械痛和热痛阈值的变化;同时,利用旷场实验和转棒实验,检测下调ACC区LXRα、LXRβ表达对小鼠自主运动能力的影响,以确保痛行为检测的准确性。1.6确定GW3965发挥镇痛效应的LXRs受体亚型途径采用慢病毒shLXRα、shLXRβ下调ACC区LXRα、LXRβ表达后,给予GW3965预处理,并建立CIP小鼠模型,观察shLXRα、shLXRβ对GW3965镇痛作用的影响,以确定GW3965发挥镇痛效应的LXRs受体亚型。2激活LXRs对CIP小鼠镇痛作用的机制研究2.1 CIP小鼠ACC区胶质细胞状态的变化Western blot方法检测CIP小鼠ACC区星形胶质细胞标志物GFAP、小胶质细胞标志物Iba-1表达水平的变化。2.2 GW3965对CIP小鼠ACC区丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPKs)信号通路的影响Western blot方法检测GW3965治疗前后,CIP小鼠ACC区MAPKs信号通路(ERK、JNK和p38磷酸化水平)的变化。2.3确定LXRs不同受体亚型在GW3965抑制MAPKs激活中的作用shLXRα和shLXRβ下调ACC区LXRα和LXRβ表达后,建立CIP小鼠模型,并给予LXRs的激动剂GW3965治疗,观察shLXRα、shLXRβ对CIP中GW3965介导的抑制MAPKs信号通路激活作用的影响,确定介导GW3965调控MAPKs信号通路的LXRs受体途径。2.4 GW3965对CIP小鼠ACC区核因子-κB(Nuclear factor-κB)信号通路的影响免疫共沉淀(Co-immunocoprecipitation,Co-IP)方法检测ACC区LXRβ与NF-κB p65之间是否存在相互作用。免疫荧光染色、Western blot方法检测给予GW3965治疗前后,CIP小鼠ACC区NF-κB p65和p50核转位活动的变化。2.5 GW3965对CIP小鼠ACC区促炎细胞因子释放的影响ELISA检测GW3965治疗前后CIP小鼠ACC和血清中TNF-a表达水平的变化。2.6 GW3965对CIP小鼠ACC区异常的突触传递的影响全细胞膜片钳检测CIP小鼠ACC区神经元兴奋性突触传递,包括由α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor,AMPAR)介导的微小兴奋性突触后电流(miniature Excitatory postsynaptic currents,mEPSCs)发放的频率和幅度,以及不同输入电压下兴奋性突触后电流(Excitatory postsynaptic currents,EPSCs),即Input-Output(I-O)曲线的变化。3组蛋白乙酰化修饰调控CIP中LXRβ表达的机制研究3.1 CIP小鼠ACC区组蛋白去乙酰化酶(HDACs)表达的变化Western blot检测CIP小鼠ACC区HDACs,包括HDAC2和HDAC5表达水平的变化,并观察其与ACC区LXRβ表达水平变化的关系。3.2 HDAC抑制剂(HDACI)SAHA对乙酰化组蛋白和LxrβmRNA水平的影响培养原代胎鼠皮层神经元,给予HDACI SAHA处理,Western blot检测乙酰化组蛋白H3(AcH3)和乙酰化组蛋白H4(AcH4)表达水平的变化,实时定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测LxrβmRNA水平的变化。3.3确定乙酰化组蛋白在Lxrβ启动子区域结合的位点针对Lxrβ转录起始位点上游2,000 bp的基因序列,设计、合成匹配度最佳的特异性引物。收集原代皮层神经元细胞,行染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)检测,结合PCR产物的启动子扩增测序,确定乙酰化组蛋白AcH3和AcH4在Lxrβ启动子区的结合位点。3.4 SAHA对Lxrβ启动子区乙酰化组蛋白水平的影响SAHA处理原代皮层神经元,采用ChIP结合RT-PCR,神经元AcH3和AcH4在Lxrβ启动子区的表达变化,以确定SAHA对Lxrβ转录的调控作用。【研究结果】1激活LXRs在改善CIP小鼠痛行为中的作用1.1 LXRs在ACC区的表达分布及细胞表达模式免疫荧光染色结果显示,LXRβ在ACC区广泛表达,而LXRα在ACC区的表达则很低。LXRβ主要表达在神经元,少量表达在星形胶质细胞和小胶质细胞。此外,LXRβ高表达于兴奋性神经元,少量表达在抑制性神经元上。1.2 CIP小鼠ACC区LXRs表达的变化Western blot和免疫组织化学染色结果显示,与Sham组相比,CIP小鼠ACC区LXRβ的表达显著降低,LXRα的表达很低且无显著变化。1.3 LXRs的激动剂GW3965对CIP小鼠痛行为的影响给予小鼠GW3965(0.1、1或10 mg/kg,i.p)的预处理或后治疗,可显著缓解CIP小鼠的痛觉超敏,且GW3965的镇痛作用呈剂量依赖性。1.4 GW3965对CIP小鼠ACC区LXRs表达及功能的影响Western blot结果显示,GW3965预处理不影响CIP小鼠ACC区LXRs的表达水平。ELISA结果显示,GW3965可显著提高CIP小鼠ACC和血清中ABCA1和ApoE的表达水平。1.5 shLXRs下调ACC区LXRs的表达对小鼠痛行为的影响Western blot结果显示,shLXRα、shLXRβ感染ACC区可显著下调LXRα、LXRβ的蛋白表达。Von Frey和热刺痛仪结果显示,与shNC组相比,下调ACC区LXRβ的表达,引起小鼠的热痛觉超敏,但不影响小鼠机械痛阈值。下调小鼠ACC区LXRα的表达,不影响小鼠的痛行为。旷场和转棒实验结果显示,shLXRs不影响小鼠的自主活动能力和焦虑行为。1.6确定GW3965发挥镇痛效应的LXRs受体途径Von Frey和热刺痛仪结果显示,shLXRβ可阻断GW3965对CIP小鼠的镇痛作用,而shLXRα不影响GW3965的镇痛效应,提示GW3965通过激活LXRβ受体亚型发挥镇痛作用。同时,shLXRβ增强CIP小鼠的热痛觉超敏,更加证明LXRβ在慢性痛发生发展中的重要作用。2激活LXRs对CIP小鼠镇痛作用的机制研究2.1小鼠ACC区胶质细胞状态的变化Western blot结果显示,CIP小鼠ACC区星形胶质细胞标志物GFAP的表达显著升高,小胶质细胞标志物Iba-1表达水平则无明显变化。2.2 GW3965对CIP小鼠ACC区激活的MAPKs信号通路的影响Western blot结果显示,与Sham组相比,CIP小鼠ACC区MAPKs信号通路相关蛋白p-ERK、p-JNK的表达水平显著提高,而p-p38的表达无明显变化;给予GW3965治疗可显著抑制ERK和JNK的磷酸化。2.3确定LXRs的不同受体亚型在GW3965抑制激活的MAPKs信号通路中的作用Western blot结果显示,下调小鼠ACC区中LXRβ的表达,可部分阻断GW3965介导的对p-ERK、p-JNK的抑制作用。下调ACC中LXRα的表达,无此抑制作用。2.4 GW3965对CIP小鼠ACC区NF-κB信号通路的影响Co-IP实验证明,ACC区LXRβ与NF-κB p65之间存在相互作用。Western blot结果显示,与Sham组相比,CIP小鼠ACC区NF-κB信号通路被激活。GW3965治疗可显著抑制IkBα的磷酸化、p65和p50的核转位。2.5 GW3965对CIP小鼠ACC区促炎细胞因子释放的影响ELISA结果显示,CIP小鼠ACC区促炎细胞因子TNF-α表达显著增加。GW3965可显著减少TNF-α的释放。2.6 GW3965对CIP小鼠ACC区异常的突触传递的影响全细胞膜片钳结果显示,与Sham组相比,CIP小鼠ACC区锥体神经元EPSCs的I-O曲线斜率、mEPSC发放频率显著增加。脑片灌流GW3965,可抑制神经元异常增强的I-O曲线斜率及mEPSC发放频率。3组蛋白乙酰化修饰调控CIP中LXRβ表达的机制研究3.1 CIP小鼠ACC区组蛋白去乙酰化酶(HDACs)表达的变化Western blot结果显示,与Sham组相比,CIP小鼠ACC区HDAC5表达水平显著增加,而HDAC2表达无明显变化。相关性分析显示,ACC区HDAC5的表达与LXRβ表达呈负相关。3.2 HDACI SAHA对乙酰化组蛋白和LxrβmRNA表达水平的影响Western blot结果显示,与Sham组相比,用SAHA处理原代皮层神经元,可显著增加AcH3和AcH4的表达水平。RT-PCR结果显示,SAHA可显著提高神经元LxrβmRNA的表达水平。3.3确定乙酰化组蛋白在Lxrβ启动子区域结合的位点RT-PCR产物的一代测序结果显示,AcH3和AcH4分别结合于Lxrβ转录起始位点上游大约1,900 bp(启动子I)、1,600 bp(启动子II)、和350 bp(启动子IV)区域,与Lxrβ转录起始位点上游大约1,100 bp(启动区III)的区域没有结合。3.4 HDACI SAHA对Lxrβ启动子区乙酰化组蛋白水平的影响ChIP结合RT-PCR结果显示,与Sham组相比,SAHA处理神经元1 h后,Lxrβ启动子I、启动子II和启动子IV区AcH3的表达即显著升高,24 h内逐渐降低恢复至基础水平。AcH4的表达无明显变化,提示,SAHA通过增加Lxrβ启动子区的AcH3水平,促进Lxrβ的转录活动。【研究结论】我们的研究揭示了LXRβ功能失调参与CIP神经炎症反应和中枢敏化;GW3965镇痛作用通过激活LXRβ实现;首次阐明了组蛋白乙酰化修饰调控LXRβ表达下降,参与CIP发病的表观遗传学机制。总结如下,(1)ACC区LXRβ的表达及功能异常参与慢性炎性痛的发生发展。(2)下调ACC区LXRβ的表达,引起小鼠的热痛觉超敏行为。(3)GW3965激活LXRβ,通过抑制ACC区神经炎症反应和异常的兴奋性突触传递发挥镇痛效应。(4)CIP小鼠ACC区HDAC5与LXRβ表达呈负相关。(5)HDAC5可能通过抑制Lxrβ启动子区AcH3水平,促进组蛋白去乙酰化,抑制Lxrβ转录,调控其表达。因此,我们的研究结果不仅阐明了LXRβ在慢性炎性痛中的作用和调控机制,也为慢性痛的治疗提供了新的策略和药物开发靶点。
【图文】：

外周,介质,痛觉感受器

空军军医大学博士学位论文伤通常伴随着内源性因子的积累，这些内源性因子是由损伤区域内或域激活的痛觉感受器或者包括肥大细胞巨噬细胞嗜碱性细胞中化细胞内皮细胞和成纤维细胞等非神经细胞释放的ǐ这些内源性因汤”，包括神经递质类花生酸和相关脂类（如前列腺素凝血酶白大麻素）肽类（如降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide, CG P 物质）神经营养因子（Neurotrophic factors, NTFs）细胞外蛋白趋化因子和质子，代表了一连串广泛的信号分子ǐ痛觉感受器表达胞表面受体能够识别并对每一种促炎或致痛介质作出反应（图 1）ǐ这强神经纤维的兴奋性，提高其对温度或触碰的敏感性ǐ

示意图,示意图,痛觉感受器,突触

图 2 中枢敏化示意图（Cell. 2009 Oct 16;139(2):267-84.）（1）Glu/NMDAR 介导的敏化过程急性痛时，痛觉感受器的中枢末端释放 Glu，通过激活突触后 AMPAR 和红藻氨酸亚型的离子型 Glu 受体，促使脊髓背角二级神经元产生兴奋性突触后电流（Excitatory postsynaptic currents, EPSCs）ǐ突触后神经元的阈下 EPSCs 的总和最终会导致动作电位放电，并将疼痛信息传递给更高级的神经元ǐ急性痛的情况下，Glu通道的 NMDAR 亚型是静息的，但外周损伤发生时，痛觉感受器释放的神经递质增多，促进突触后神经元充分去极化，NMDAR 激活，增加 Ca2+内流，终致脊髓背角疼痛传导神经元与痛觉感受器间的突触交流和联系增强，进而发生痛觉敏化（即机体对有害刺激的反应加强）ǐ慢性痛会诱导脊髓长时程增强（Long-term potentiation, LTP）的产生[32]ǐ药物阻断脊髓 LTP 可减少组织损伤引起的痛觉超敏ǐ脊髓的中枢敏化依赖 NMDAR 介导的
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R402

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