扬州市结核分枝杆菌分离株的分子流行病学研究

发布时间：2020-05-04 21:04

【摘要】：结核病(Tuberculosis,TB)是全球最严重的人兽共患病之一,严重危害人类身体健康,给全球公共卫生安全带来严重的挑战。自1882年德国科学家Koch揭示了结核分枝杆菌分离株(Mycobacteriumtuberculosis)是结核病的病原菌,开启了对结核病深入研究。结核分枝杆菌分离株是一种体积微小,为杆状的革兰阳性菌,无鞭毛、无芽孢。通过抗酸染色法(acid-fast stain)可以检测出病样中是否存在结核分枝杆菌分离株。在临床上,结核分枝杆菌分离株主要感染人的肺部,患者往往表现出剧烈的咳嗽,并伴有痰或者血丝、身体无力、胸口疼痛、低烧、盗汗等症状。根据世界卫生组织报道,2016年全球新发结核病人约1040万,TB/HIV双重感染约为103万,MDR-TB感染患者60万,并列出了 2016年全球有14个国家同时面临着TB、TB/HIV和MDR-TB的挑战,其中包括中国。因此,对结核分枝杆菌分离株临床诊断、药物治疗和结核病防控,成为我国重大传染病防控工作中的重中之重。本研究以扬州市结核病作为研究对象,对结核分枝杆菌分离株进行流行病学调查和药敏试验;采用MLVA分子分型方法研究扬州市结核分枝杆菌分离株的基因型特点,分析基因型与耐药、性别、年龄和时间上是否有潜在的相关性;基于全基因组序列对结核分枝杆菌分离株进行谱系分析、耐药性预测并对其预测的结果准确性进行评估。1扬州市结核分枝杆菌分离株流行病学研究从人口分布上看,扬州市结核病患者中男性多于女性,流动人口超过本地人口的1.5倍。在年龄分布上,在35岁以下和60岁以上,女性患者比其他年龄阶段人数要多,呈现出“双峰”现象。在职业分布方面,结核病患者主要集中在农民、离退休人员、家政服务人员这三个职业,以农民居多。从时间分布上看,扬州市结核病主要流行于春夏两个季节。对扬州市收集的327例临床菌株,采用PNB/TCH检测法和多位点PCR两种方法鉴定出311株为结核分枝杆菌分离株,16株为非结核分枝杆菌分离株,其中包括1株M.canettii和1株M.africanum subtype I。对176株结核分枝杆菌分离株进行药敏试验,有76株菌株表现耐药,总体耐药率为43.18%,比全国第五次结核病流行病学抽样调查高出1.08个百分点,说明扬州市分离株总体耐药水平较高,复发患者比新患者更容易出现耐药情况。从细菌学方面看,涂阴培阳菌株具有很高的耐药性风险,要重视对涂阴培阳患者药物敏感性试验,及时准确诊断,防止产生耐药性。2扬州市结核分枝杆菌分离株的MLVA研究采用24个MIRU-VNTR基因位点对收集的扬州市325株结核分枝杆菌分离株进行分子分型研究,发现有11株结核分枝杆菌分离株为混合感染菌株。对314株单一型的结核分枝杆菌分离株进行VNTR基因位点重复次数分析,发现不同菌株对不同VNTR基因位点都存在偏好性。通过计算,成簇率为11.46%,并对成簇菌株可能存在传染性风险因素进行分析,使得走访调查具有导向性。同时对24个MIRU-VNTR基因位点多态性进行了分析,计算出高分辨力位点有Mtub21和 QUB11b;中分辨力位点有 Mtub04、MIRU40、MIRU10、MIRU16、MIRU26、MIRU31;ETRE、QUB26、QUB4156、MIRU39和ETRA,这12个位点更适合作为扬州市的结核分枝杆菌分离株分子分型研究。与相关国际数据库比较发现扬州市结核分枝杆菌分离株基因型具有明显的聚集性,具有一定的保守性。3扬州市结核分枝杆菌分离株的全基因组测序初步分析从扬州市临床分离株中选取94株结核分枝杆菌分离株进行全基因组测序,获取全基因组序列,并对每株结核分枝杆菌分离株的全基因组进行耐药性预测。通过与药敏试验结果比较,一致率都超过了 70%,其中对INH、RFP、EMB、SM四种一线抗结核药物一致率分别为:82.56%、95.24%、86.90%和 86.90%,对 CPM、AK、PAS、LVFX 四种二线抗结核药物一致率分别为:92.86%、91.67%、94.40%、73.81%。这也表明了基于全基因组序列对临床分离株的耐药性预测准可靠性较高,但是对LVFX的耐药性预测可靠性不高。利用核心SNVs数据库对扬州市94株结核分枝杆菌全基因序列进行谱系分析,84株菌株为Lineage2、10株菌株为Lineage4,其中以Lineage2为扬州市主要的谱系,而这些Lineage 2的菌株又都为北京家族。基于全基因组序列对94株结核分枝杆菌分离株进行聚类分析,其结果与谱系分析结果一致。
【图文】：

国家,双重感染,耐多药,结核病

因邋ＴＢ／ＨＩＶ邋双重感染死亡的人数邋３７邋万；ＭＤＲ－ＴＢ（ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ邋ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，耐多药逡逑结核病）患者约６０万，死亡２４万（ＷＨＯ．，邋２０１７）。全球有１４个国家同时面临着ＴＢ、ＴＢ／ＨＩＶ逡逑和ＭＤＲ－ＴＢ的挑战（图１）。逡逑ＴＢ逡逑Ｃａｍｉｊｏｄｉａ＊１逡逑Ｓｉｅｒｒａ邋ｌｅｏｎｅ＊逡逑Ｓａｎｏｌａｄｅｓｈ逦Ｂｒｓａｌｌ逡逑Ｓ＾Ｋｏｆｅａ逦Ｃｅｎｔｒａｌ邋Ａｆｒｋａｎ邋ＲｅｐｕＮｋ１１邋？逡逑Ｐａｋｉｓｔａｎ逦＿／＾＊＊＂＂＊＊＼逦Ｃｏｎｇｏ＊逡逑Ｐｆｊｔｉｉｐｐｉｎｅｓ逦／邋Ｘ逦Ｌｅｓｏｔｈｏ４逡逑；：Ｒｕｓｓｉａ邋ｆｅｄｅｒａｔｌａｆｙ＾邋Ａｎｇｅｌａ邋＼逦Ｌｉｂｅｒｉａ４逡逑Ａｚｅｒｂａｉｊａｎ逦Ｖｉｅｔ邋Ｎａｍ邋／邋Ｃｈｍａ邋＼邋Ｎａｍｉｂｉａ＊逡逑Ｂｅｉａｒｕｓ逦／邋ＤＲＣｏｏ＾ｏ邋Ｖ邋ＵＲＴａｎｚａｔｉｉａ逦Ｂｏｔｓｗａｎａ逡逑Ｋａｚａｋｈｓｔａｎ逦ｔｔｈｓｏ＾ａ逦＼逦Ｚａｍｂｉａ？逦Ｃａｍｅｒｏｏｎ逡逑Ｖ逦＾逡逑ｉｓ？逡逑Ｕｚｂｅｋｉｓｔａｎ逦＼邋Ｓｏｕｔｈ邋Ａｆｒｉｃａ邋／逡逑＼邋Ｔｈａｉｉａｎｄ邋／逡逑＼Ｚｉｍｂｄｂｍｙ逡逑ＭＤＲ－ＴＢ逦ＴＢ／ＨＩＶ逡逑图１邋ＴＢ、ＴＢ／ＨＩＶ和ＭＤＲ－ＴＢ氋负担国家逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ｈｉｇｈ－ｂｕｒｄｅｎ邋ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ邋ｌｉｓｔｓ邋ｆｏｒ邋ＴＢ，邋ＴＢ／ＨＩＶ邋ａｎｄ邋ＭＤＲ－ＴＢ逡逑

测序技术,全基因组

１全基因组测序技术进展概况逡逑全基因组测序技术始于第一代ＤＮＡ测序技术即Ｓａｎｇｅｉ？法，经过三十多年的发展，己逡逑发展到第三代（图２）。测序的读长也随着技术发展由长到短，再由短到长。根据美国国逡逑立生物技术信息中心（Ｎａｔｉｏｎａｌ邋Ｃｅｎｔｅｒ邋ｆｏｒ邋Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＣＢ丨）数据库统计，逡逑第二代短读长测序技术在全球测序市场中占有绝对的优势。而第三代测序技术，弥补了第逡逑二代测序技术中的不足，对药物研发、疾病研宄、基因组研究等方面有很大的推动作用。逡逑Ｓｉｎｇｌｅ邋ｍｏｌｅｃｕｌｅ逡逑Ｒｅａｌ邋Ｄｍｃ（ＳＭＲＴ）逡逑Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ逦（２００９）逡逑逦邋（２００８）逡逑（１９５３）逦Ｎａｎ0Ｐ0ｒＵ逡逑中心湖逦（１９Ｖ８）逦（２００Ｘ）逡逑丨中＝逦炎光＿邋！逦ｉ逦］逦１二逡逑第一台商用逦（２０＾０）逡逑ｉｉｎｖ密码逦ｒ丨动捎中_咤义希ǎ保梗叮叮╁危ǎ保梗福罚惧义弦弧危巍叔澹义希皱澹皱蜰邋畲逦＿N．．．．．．．．．．邋逦逦逦逦逦逦逦逦＾二逡逑■■■■■■了，严逦▲逦八八邋Ｉ邋Ｖ邋暴．．．．凡…一邋｜逦，，只－＾｜ｒ－ｉｉ「ｉｎ－－－－－－－ｎｉｉｒｎ邋，＇晷，逡逑Ｉ９５０ｊ逦１９６０逦１０７０邋Ｉ邋１＜）８０逦！９＜）０邋’逦２００＾逦ｊ邋＼逦ｉ0ｌ0逡逑＾逦１逦毛细费电泳逦（２００５）逡逑Ｉｒｊｖ＊邋Ｉ？邋ｉｆ－逦＾Ｓａｎｇｅｒ逦Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ逦ｒ逦ＧｃＸＰ逡逑＾逦＜＿逦遍逦＾ｏ
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

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