定量蛋白质组学技术探索粪肠球菌对利奈唑胺低水平耐药机制

发布时间：2020-05-15 15:12

【摘要】：目的:目前明确的几种肠球菌对利奈唑胺的耐药机制未能充分解释肠球菌低水平耐利奈唑胺(MIC:8-16 mg/L)现象。根据课题组现有研究基础我们推断肠球菌低水平利奈唑胺耐药现象可能与膜蛋白参与有关,本研究旨在明确膜蛋白在低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌中的作用。方法:1、本研究首先采用Tandem Mass Tag(TMT)技术对与转录组测序相同的一株低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌(P10748)及两株敏感菌株(3138、ATCC29212)的膜蛋白进行定性及定量分析,经生物信息学分析得到利奈唑胺耐药株相对于敏感株的差异表达膜蛋白,结合RNA-Seq结果,对差异蛋白质进行验证。2、提取细菌总DNA,采用PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增方法检测我院检验科临床微生物室2014年至2017年间收集到的43株低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌(optrA阳性率100%)中esp,sea1基因携带率。对菌株P10748的质粒进行测序分析。结果:1、三株菌的膜蛋白质经谱分析共得到362,473条原始光谱,经筛选(FDR=1%)得到50,635条有效光谱其中特异性光谱50,285条,对应8,197条肽段,特异性肽段8,144条。经Nr(NCBI non-redundant)等数据库检索查询得到1,170个蛋白。GO功能注释结果显示,“催化活性”,“代谢过程”,“细胞”和“细胞部分”分别是分子功能、生物学功能和细胞成分中注释最多的条目;COG功能分析中富集最多的前三个条目分别为:“碳水化合物转运及代谢”,“翻译,核糖体结构及生物发生”,“仅一般功能预测”。KEGG通路分析中富集程度最高的通路有:代谢,次级代谢生物合成,抗生素合成,不同环境中的微生物代谢以及ABC转运体。基于原始数据和各比较组的共同差异筛选(条件:fold change1.2,P0.05),最终得到14个显著上调蛋白(分别是:类胶原蛋白、AmaP、Sea1、DNA结合蛋白(XBE家族转录调节蛋白)、RepA、脂蛋白、TraB、DUF3329结构域蛋白、Esp、保守域蛋白、OptrA及三个功能未知蛋白)和6个下调蛋白。2、显著差异表达蛋白及其转录组数据的皮尔森相关性分析显示两者具有明显相关性:P10748和ATCC29212菌株的Pearson相关系数r=0.675,P=0.001;P10748和3138菌株的Pearson相关系数r=0.698,P=0.001。3、P10748和ATCC29212菌株差异蛋白的GO富集分析显示分子功能中“跨膜转运活性”、生物过程中“金属离子转运”及细胞成分中“膜”条目的富集程度最高;P10748和3138菌株差异蛋白GO富集分析显示分子功能中“底物特异性跨膜转运蛋白活性”、生物过程中“离子转运”及细胞成分中“膜”条目的富集程度最高。差异蛋白的Pathway通路富集主要集中于群体感应(QS)通路,磷酸转移酶系统(PTS)通路和泛酸与CoA生物合成通路。4、差异表达蛋白中Sea1对应的编码基因在转录组测序结果中未体现差异,PCR扩增试验提示sea1基因在P10748菌株中特异性表达,经序列比对,该sea1基因序列与粪肠球菌质粒pAD1上的sea1基因序列(GenBank No.X62658.1)相似性为91%,与粪肠球菌质粒pMG2200上的sea1基因序列(GenBank No.AB374546.1)相似性为98%。RT-PCR结果同样说明这三株菌中sea1基因只在低水平利奈唑胺耐药菌株中特异性表达。5、43株非重复利奈唑胺低水平耐药肠球菌中sea1的阳性率为74.4%,esp的阳性率为76.7%。结论:1、蛋白OptrA和Esp在低水平利奈唑胺耐药粪肠球菌P10748菌株中表达明显上调,与RNA-seq结果一致,表明optrA和esp参与了利奈唑胺的耐药过程,为明确肠球菌对利奈唑胺低水平耐药现象提供了可供参考的耐药靶标。2、optrA基因可能位于信息素质粒上,其水平转移过程可能由Sea1、TraB、RepA及XRE家族转录调控蛋白参与调节。3、肠球菌低水平耐利奈唑胺现象也可能与Esp等膜蛋白参与的生物膜形成相关。
【图文】：

重庆医科大学硕士研究生学位论文生物合成（115 个蛋白）；仅一般功能预测（112 个蛋；细胞壁、膜、生物膜合成（97 个蛋白）（图 1.2）。蛋白归类到 202 个代谢通路，富集程度最高的五个通100，236 个蛋白，25.88%），刺激代谢产物生物合成%），抗生素生物合成（ko01130，78 个蛋白，8.55%（ko01120，75 个蛋白，8.22%），，及 ABC 转运蛋白）。

22图 1.2 三株粪肠球菌膜蛋白的 COG 功能分析.2 COG function analysis of membrane proteins identified in three E. faecaX 轴代表蛋白的数目；Y 轴代表 COG 条目: X axis represents the number of proteins. Y axis represents the COG terms异蛋白筛选及功能预测粪肠球菌的三个重复组进行两两比较，菌株 P10748 和 ATCC2524个差异表达蛋白，包括上调蛋白274个，下调蛋白250个。菌 之间共鉴定到 377 个差异表达蛋白，包括 270 个上调蛋白和 1071.3）。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.5

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