肺胞外基质水凝胶治疗大鼠放射性肺损伤的研究

发布时间：2020-05-15 15:41

【摘要】：背景及目的:放射性肺损伤(RILI)是胸部肿瘤放疗中常见的并发症。持续存在的炎症反应、氧化应激损伤及后期纤维化是其主要病理生理特点。肺胞外基质(ECM)支架材料是离体肺经过SDS、Triton-X-100等化学灌注的方法洗脱细胞、裂解脂膜后,得到的包含较完整结构和功能的蛋白复合体的细胞外基质成分,对多种细胞学行为具有调节作用。通过进一步研磨、酶消化后将ECM支架材料制成温敏性水凝胶,能黏附于组织局部持续发挥作用。既往研究报道肺胞外基质材料有抑制炎症、氧化损伤及纤维化的作用,为阐明肺ECM对放射性肺损伤是否具有治疗作用,本研究在建立气管注射肺ECM水凝胶治疗放射性肺损伤大鼠模型的基础上,初步观察肺ECM水凝胶对大鼠放射性肺损伤的治疗作用,通过观察肺ECM水凝胶对肺泡上皮细胞间质化过程的影响,对可能的治疗机制进行探讨。方法及结果:第一部分:肺ECM水凝胶治疗放射性肺损伤大鼠模型的制备方法:1.肺ECM制备及组织相容性评价脱细胞法制备肺ECM材料,通过HE染色、电镜等检测方法验证脱细胞效率;将ECM制成水凝胶材料,并将一定剂量的水凝胶材料注射到正常大鼠皮下,1周后切除注射点周围组织,免疫荧光染色,观察材料组织相容性。2.放射性肺损伤大鼠模型评价9只大鼠,分为2组:对照组(正常大鼠,3只)、照射组(6只),单次全肺20Gy照射制备RILI模型,照射后第7天,处死,取肺,HE染色,观察肺组织病理变化。取血清,Elisa法检测TNF-α、IL-6水平变化。3.放射性肺损伤大鼠气管内注射肺ECM水凝胶适宜剂量的筛选24只RILI大鼠在照射后半小时随机分为4组,环甲膜穿刺法分别注射肺ECM水凝胶0μl、300μl、500μl、800μl,比较各组大鼠注射后半小时内死亡率、动脉血氧分压,以及采用免疫荧光染色法观察材料在气道内的分布情况。结果:1.脱细胞法成功制备肺ECM支架,HE染色及电镜检查可见有核细胞成分洗脱较彻底,胞外基质三维结构保存完好。肺ECM水凝胶皮下注射1周后观察,材料周围未见明显的炎性细胞浸润。2.照射后7天,肺组织HE染色显示:肺间质增厚,细胞浸入增加,局部肺泡腔可见渗出、出血。Elisa法检测结果显示:照射组大鼠血清TNF-α、IL-6分别为(98.79±12.12)pg/ml、(75.67±9.22)pg/ml;对照组大鼠血清TNF-α、IL-6分别为(57.11±9.11)pg/ml、(35.14±4.25)pg/ml,照射组显著高于对照组(P㩳0.05)。3.气管注射肺ECM水凝胶300μl或500μl均不会影响大鼠动脉血氧分压(P0.05),而气管内注射800μl则会造成大鼠动脉血氧分压下降(P㩳0.05),荧光显微镜下观察,300μl、500μl、800μl组均能在肺泡表面观察到带绿色荧光的水凝胶材料分布,而800μl组可见部分水凝胶在气道内滞留。第二部分:肺ECM水凝胶对大鼠放射性肺损伤的治疗效果研究方法:1.肺ECM水凝胶对放射性肺损伤过程中炎症反应的作用54只大鼠,随机分为3组:Control组(正常大鼠,n=18)、IR+NS组(照射+气管内注射生理盐水,n=18)、IR+ECM组(照射+气管内注射肺ECM水凝胶,n=18)。于照射后第4、8、16周,每组处死6只大鼠,比较各个时间点各组:肺湿/干重比、肺组织病理变化(HE染色、Masson染色)、血清TNF-α、IL-6、TGF-β1水平(Elisa法)。2.肺ECM水凝胶对放射性肺损伤过程中氧化损伤的作用54只大鼠,随机分为3组:Control组(正常大鼠,n=18)、IR+NS组(照射+气管内注射生理盐水,n=18)、IR+ECM组(照射+气管内注射肺ECM水凝胶,n=18)。于照射后第4、8、16周,每组处死6只大鼠,取肺,测SOD活性、MDA含量。结果:1.与IR+NS组比较,在照射后第4、8、16周,IR+ECM组大鼠血清TNF-α、IL-6、TGF-β1水平下降(P0.05),肺组织湿/干重比降低(P㩳0.05),HE染色显示肺组织病理改变改善,Masson染色显示染蓝的胶原纤维在肺组织沉积减少。2.与IR+NS组比较,在照射后第4、8、16周,IR+ECM组大鼠肺组织中MDA含量减少(P㩳0.05),SOD活力增强(P㩳0.05)。第三部分:肺ECM水凝胶对放射诱导的肺泡上皮细胞-间质转化过程的作用研究方法:1.肺ECM水凝胶对肺组织上皮间质转化水平变化的作用36只大鼠,分为3组:Control组(正常大鼠,n=12)、IR+NS组(照射+气管内注射生理盐水,n=12)、IR+ECM组(照射+气管内注射肺ECM水凝胶,n=12)。于照射后第4、16周,每组处死6只大鼠,取肺,免疫组化染色及western blot检测法比较各组大鼠肺组织中E-cadherin、vimentin、α-SMA水平变化。2.肺ECM水凝胶对肺组织中羟脯氨酸含量的影响36只大鼠,分为3组:Control组(正常大鼠,n=12)、IR+NS组(照射+气管内注射生理盐水,n=12)、IR+ECM组(照射+气管内注射肺ECM水凝胶,n=12)。于照射后第4、16周,每组处死6只大鼠,取肺,测羟脯氨酸含量变化(碱水法)。结果:1.与IR+NS组比较,照射后第4、16周,IR+ECM组大鼠肺组织中E-cadherin表达水平均增加,vimentin、α-SMA表达水平均降低(P㩳0.05)。2.与IR+NS组比较,照射后第4、16周,IR+ECM组大鼠肺组织中羟脯氨酸含量减低(P㩳0.05)。全文结论:1、放射性肺损伤大鼠环甲膜穿刺气管内注射500μl的肺ECM水凝胶,不会明显降低大鼠的血氧分压或增加大鼠的死亡率,且材料可以较均匀的分布于肺泡表面。2、气管内注射肺ECM水凝胶可以抑制放射性肺损伤大鼠全身炎症反应,减轻照射后肺组织局部的炎症、氧化损伤,并减轻后期纤维化。3、肺ECM水凝胶能抑制放射性肺损伤大鼠肺泡上皮细胞的上皮间质转化过程,从而减轻肺纤维化的严重程度。这可能是肺ECM水凝胶发挥治疗作用的主要机制之一。
【图文】：

支架,胞核,成分

Fig.1 Preparation of lung ECM scaffold图 1 肺 ECM 支架的制备；B：脱细胞之后；C：正常大鼠肺 HE 染色；D：肺 EC胞核成分（HE×200）lularization;B: After decellularization;C: Normal rat lung;Dd eosin staining of lung ECM showed no blue staining of nE×200）的初步鉴定 HE 染色及扫描电镜检查，可见胞核已被完全清维结构保留。

组织相容性,HE染色

Fig.2 Hematoxylin and eosin staining and electron microscopic observation ofpulmonary ECM（×200）图 2 肺 ECM 的 HE染色及电镜观察（×200）A：HE染色；B：电镜镜下观察A: Hematoxylin and eosin staining;B: Observation under electron microscope3.组织相容性评价皮下注射 7 天后，切除局部皮下组织，，行免疫荧光染色，可见肺水凝胶分布于皮下，周围未见明显炎细胞浸润。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R730.55

【相似文献】