肠出血性大肠杆菌快速检测芯片的制备及性能研究

发布时间：2020-05-15 18:59

【摘要】：食品和饮用水安全直接关系人们身体健康和生命安全,发展对食品和饮用水质量的快速检测技术是确保食品和饮用水质量的重要保证。细菌感染是引起食物中毒的主要原因之一,尤其致病菌引起的食物污染能引起更严重的后果,本论文研究的肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7能引起严重疾病甚至死亡,其感染剂量低,轻者腹泻、便血,重者可得急性肾衰竭,快速检测和鉴定EHEC O157:H7是预防和有效治疗的关键。目前对于EHEC O157:H7的检测通常采用最传统的平板计数法,其可信度高,但步骤繁琐耗时过长。为了快速检测并鉴定样品中是否含有EHEC O157:H7,本论文利用抗原和抗体之间的特异性识别作用,采用层层自组装技术构建了基于平面基底和三维微纳结构基底的生物传感器,进而结合鱼骨结构PDMS芯片的涡旋搅拌效果,开发了能特异性捕获EHEC O157:H7的高级微流控芯片,并构建了集EHEC O157:H7捕获、培养、释放、裂解、扩增于一体的芯片实验室。论文的主要研究内容如下:本论文利用层层自组装技术制备了基于平面基底的碳纳米管多层膜的生物传感器,对EHEC O157:H7的捕获效率和检测下限进行研究,结果显示捕获效率约为60%,检测下限为1 CFU/m L。此外,此生物传感器还具有专一性、生物相容性、重复使用性、稳定性以及实际应用性。为了增强基底与EHEC O157:H7的接触面积和进一步提高其捕获效率,采用纳米压印技术制备了具有三维微纳结构的基底,研究表明三维微纳结构的存在有利于提高EHEC O157:H7的捕获效率。通过图形尺寸、高度、间隔的优化,筛选出最优的三维微纳结构为边长为6μm,高度为2μm,间隔为2μm,进一步修饰碳纳米管薄膜后可将最优三维微纳结构基底构建的生物传感器对EHEC O157:H7的捕获效率提高到80%,检测下限为1 CFU/m L。此外,此生物传感器还具有良好的专一性、生物相容性、稳定性和实际应用性。为促进EHEC O157:H7与传感器的接触进而提高其捕获效率,本论文构建了基于ITO基底和最优三维微纳结构基底的微流控芯片。微流控芯片上层采用具有鱼骨结构的PDMS芯片,实验证明鱼骨结构对流体具有涡旋搅拌的效果,增强了EHEC O157:H7的捕获效率,其中鱼骨结构PDMS芯片与最优三维微纳结构基底组合的微流控芯片具有高达95%的细菌捕获效率,检测下限为1CFU/m L。此微流控芯片不仅具有优越的细菌捕获性能,还具有较好的专一性和良好的实际应用前景。为了满足对EHEC O157:H7定性定量的要求,同时又能减少昂贵仪器的使用,本论文结合分子生物学检测手段环介导等温扩增技术,制备了八平行通道微流控芯片,利用光纤浊度传感器,实现了对EHEC O157:H7的定性定量检测。进而将ITO基底构建的阻抗型传感芯片与八平行通道环介导等温扩增微流控芯片组合,实现了EHEC O157:H7的捕获、培养、释放、裂解、扩增DNA一体化检测,检测时间少于3.5小时,检测下限为1 CFU/m L。在此基础上,将具有三维微纳结构的阻抗型芯片与微流控芯片整合为一体化多功能芯片,实现了EHEC O157:H7的一体化检测。综上所述,本论文将EHEC O157:H7的捕获效率提高到了95%,检测下限减小到1 CFU/m L,并且实现了EHEC O157:H7的定性定量一体化快速灵敏检测。
【图文】：

示意图,免疫层析,试纸条,金纳米粒子

哈尔滨工业大学工学博士学位论文行连接，所以当加入底物 TMB 时会出现颜色反应，从而证明7:H7 的存在。此种方法检测时间为 15-30 min，检测限为 500 个细5 年，张磊等人利用一步合成法合成花状金纳米粒子，并用鼠抗7:H7 修饰金纳米粒子去捕获 EHEC O157:H7，然后包含有金纳米C O157:H7 的样品加入试纸条的样品区，在毛细作用下，样品向前 EHEC O157:H7 和 T 线上相应抗体的相互识别，，最终金纳米粒子7:H7 的复合物被固定在 T 线上，从而导致金纳米粒子的聚集而使得这一现象可以被用来定量检测 EHEC O157:H7。其余被标记的金纳向前迁移，由于标记金纳米粒子的抗体与 C 线上抗体的专一性识记的金纳米粒子固定在 C 线上，如图 1-4 所示。此种方法的检测限CFU/mL[58]。

示意图,漆酶,传感器,示意图

将细菌捕获之后与二抗相连，二抗通过生物素和抗生物素蛋白之间的识别作用与葡萄糖氧化酶相连，葡萄糖氧化酶催化底物葡萄糖，产生过氧化氢。在过氧化氢形成后，通过检测化学发光强度来检测EHEC O157:H7，如图1-5所示。在最优条件下，线性检测范围为4.3×103-4.3×105CFU/mL，检测时间小于2 h，检测限为1.2×103CFU/mL，低于酶联免疫反应的检测限（1.0×105CFU/mL）。而且，这种方法被成功的用来检测合成样品中的EHEC O157:H7（泉水，苹果汁和脱脂牛奶），展现了它检测实际样品的能力[4]。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

【参考文献】