外泌体中丙酮酸激酶活性检测

发布时间：2020-05-15 19:40

【摘要】：背景:2011年美国医学界首次提出了“精准医学”的概念,2015年10月奥巴马又在美国国情咨文中提出“精准医学计划”,预示着新的医学时代到来。随着精准医学概念的提出,疾病的精确诊断和治疗受到越来越多学者的关注。外泌体由于它对疾病诊断治疗的潜在作用,在精准医学发展上有着光明的前景。外泌体是多种细胞分泌的具有脂质双层膜结构的微小囊泡,其内含有蛋白质、脂质、核酸、代谢物等,这些成分能够反映来源细胞的生理和病理状态。它广泛分布于血液、胸水、尿液等不同体液中以及有较长的半衰期。外泌体可以长时间储存在体液中,能够维持自身膜结构的完整性与渗透压,它是否具有获取能量的系统值得我们进一步探索。糖类是人体主要的供能物质,可通过无氧糖酵解和有氧氧化为细胞提供能量。丙酮酸激酶是葡萄糖酵解过程中重要的限速酶,可催化磷酸烯醇式丙酮酸酯和二磷酸腺苷(ADP)转变成丙酮酸和三磷酸腺苷(ATP)。所以,检测外泌体中丙酮酸激酶的活性,可进一步探索外泌体能否获得能量以及获取能量的方式。目的:用2,4-二硝基苯肼显色法及ICSH推荐的方法分别测定外泌体中丙酮酸激酶的活性,探索外泌体中是否存在丙酮酸激酶;比较外泌体丙酮酸激酶的活性在葡萄糖组与PBS对照组之间的差异,探索外泌体利用葡萄糖为自身提供能量的可能性。方法:使用差异超速离心的方法提取DU145、HEPA1-6和RGC-5细胞中的外泌体,透射电镜进行外泌体形态学的鉴定;用2,4-二硝基苯肼显色法及ICSH推荐的方法分别测定外泌体中丙酮酸激酶的活性;比较外泌体中丙酮酸激酶活性在葡萄糖组与PBS对照组的差异,对外泌体利用葡萄糖为自身提供能量的可能性进行分析。结果:(1)DU145、HEPA1-6和RGC-5细胞中都检测到了直径在30~120nm的圆形或椭圆形双层脂质膜的微小囊泡,鉴定为外泌体。(2)2,4-二硝基苯肼显色法测得DU145、HEPA1-6和RGC-5外泌体丙酮酸激酶活性依次为27.570IU/g、25.515IU/g和23.752IU/g;ICSH推荐方法测得DU145、HEPA1-6和RGC-5外泌体丙酮酸激酶活性依次为26.426IU/g、26.323IU/g和22.257IU/g。2,4-二硝基苯肼显色法及ICSH推荐的方法均检测出外泌体丙酮酸激酶的活性。两种方法得到的结果没有显著性差异(p0.05)。(3)葡萄糖组和PBS对照组外泌体在4℃孵育4天后,开始出现葡萄糖组丙酮酸激酶活性高于PBS对照组;两组在4℃孵育6天后,葡萄糖组外泌体丙酮酸激酶活性依然高于PBS对照组。结论:(1)本研究证实DU 145、HEPA1-6和RGC-5外泌体中存在丙酮酸激酶活性,表明外泌体中有丙酮酸激酶的存在,提示外泌体可以产生ATP维持膜结构与渗透压。(2)本研究对外泌体能否利用葡萄糖为自身提供能量的探索提供一定依据。创新性:通过对Pub Med、中国知网、万方、Google scholar等数据库的检索,均未发现与外泌体中的丙酮酸激酶活性相关的报道。本研究首次发现在外泌体中存在有活性的丙酮酸激酶。
【图文】：

糖酵解,反应步骤,供能,关键酶

以及保持稳定。1.2.4 糖酵解途径的过程和生理意义糖酵解是细胞主要的新陈代谢途径之一，是指在无氧条件下将葡萄糖转化为丙酮酸和 ATP，为机体提供能量[46]。这个途径最重要的生理意义是迅速提供能量，一旦细胞内 ATP 含量下降，细胞为满足自身对能量的需求就必须启动ATP 补偿途径（糖酵解途径）[19]。在糖酵解过程中有三个不可逆反应[47-48]，分别由已糖激酶、磷酸果糖激酶-1 和丙酮酸激酶催化，是控制糖酵解流量的三个关键酶(图 1.1)。已糖激酶催化葡萄糖变为葡糖-6-磷酸，同时消耗一分子 ATP；磷酸果糖激酶-1 催化果糖-6 磷酸生成果糖-1,6-二磷酸，同时消耗一份子 ATP；丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，同时生成一分子 ATP。这三个酶在糖酵解中反应速率最慢，催化的反应不可逆，是糖酵解途径中最重要的三个酶。

超速离心法,步骤,上清液,离心管

第 2 章材料与方法d、再次丢弃离心管里的沉淀，将上清液转移入新的四支 50ml 离心管中，4℃条件下，10,000g 离心 30 分钟此步骤目的是去除上清液中的大囊泡。e、再次丢弃离心管中的沉淀，将上清液转移至超速离心机专用的离心管中，准备进行超速离心。f、将上清液转移至超速离心机后，4℃条件下，100,000 g 离心 70 分钟。g、需要注意的是，这次我们丢弃的是上清液，保留沉淀，此时沉淀的成分主要是外泌体和一些蛋白质。将保留下来的沉淀用 PBS 溶解，将各管含有沉淀的 PBS 混为一管，随之再次进行超速离心，4℃条件下，100,000g 离心 70 分钟。h、丢弃掉上清液，保留沉淀，此时的沉淀成分主要是外泌体。用 50ul PBS重悬后，将得到的外泌体保存在-80 冰箱中备用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.1

【参考文献】