痕量小鼠骨髓造血干细胞移植体系的建立

发布时间：2020-05-19 23:18

【摘要】：【目的】造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs):指存在于造血组织中尚未发育成熟的所有血细胞和免疫细胞的前体细胞,具有自我更新和多系分化的双向潜能,HSCs的自我更新和多向分化潜能主要通过体内移植来评估和判断。成体HSCs主要存在于骨髓,通过不断分化产生各系造血祖细胞,再而分化成各系血细胞,为造血系统提供新细胞;同时HSCs通过自我更新以维持自身数量的相对稳定。HSCs作为一类重要的成体干细胞在临床中得到广泛应用,但在所有组织中比例都极低,因此寻找效率更高的富集HSCs的方法在其特性研究中至关重要。Kent等人通过给辐射后的小鼠移植骨髓ESLAM(CD45~+EPCR~+CD150~+CD48~-)细胞,发现其能够在受体小鼠体内维持长期造血重建,证实该组合分离的细胞群中含有较高纯度的造血干细胞。2016年Eaves等人用该表面标志组合分离正常成年CD45.2小鼠骨髓细胞获得纯度达40%-50%的HSCs。通常把某种物质的含量在百万分之一以下称为痕量,即极少的量,本研究就是使用ESLAM组合分选获取成体小鼠骨髓HSCs,建立痕量骨髓HSCs的移植体系,分析移植后重建及各系的分化情况。【方法与结果】第一部分:建立痕量骨髓HSCs的移植体系。参考Eaves 2016年的文章选择分选HSCs的抗体组合即ESLAM组合(CD45~+EPCR~+CD150~+CD48~-),GFP小鼠作为供体,流式细胞分选GFP小鼠骨髓细胞,30 cells/mice加骨髓细胞保护细胞,共同移植给致死剂量照射的受体小鼠,不同时间点依次对受体小鼠进行尾静脉采血流式细胞仪分析测嵌合,观察其重建水平及谱系分化情况,接着处死受体小鼠,获取骨髓、胸腺、脾脏和外周血等组织的细胞,测各组织嵌合情况。结果显示每只受体小鼠在不同时间点的嵌合以及各谱系各组织的重建比例均有差异。第二部分:通过分析造血谱系细胞的单细胞测序结果,进一步诠释成体骨髓HSCs的分子异质性,从而解释移植实验结果中各谱系各组织嵌合差异的现象。该部分研究从GEO数据库中获得1920个造血谱系细胞的单细胞测序结果,筛选出1656个单细胞做后续分析。对纳入分析的所有细胞进行基于转录组的分群,共17个亚群,发现新的分群结果中有亚群与表面标志组合定义的ESLAM群体有较高一致性,几乎包含所有的ESLAM细胞。这群细胞具有高表达EPCR(CD201),Slamf1(CD150),Ly6a(Sca-1),低表达CD34,CD48等特征。为了更好阐释转录组水平HSCs的分子异质性,我们对转录组水平定义的LT-HSCs进行了异质性分析,将LT-HSCs分为了4个亚群,分析了四个亚群的特征以及细胞周期的特性,发现LT-HSCs中存在一群细胞周期活跃且高表达红系特征的细胞,结果表明这群表面标志与ESLAM高度一致的细胞群可能具有红系分化倾向性。第三部分:探索小鼠骨髓损伤模型,基于对骨髓HSCs的转录组分析结果,参照以往动物骨折模型,希望建立骨髓损伤模型并探索骨髓干细胞在骨髓损伤中的应用,但从骨髓损伤模型建立后的组织学及影像学检测结果以及评估标准的量化方面来看,该模型仍然需要改进。【结论】以上研究结果表明ESLAM组合能够较高效率的富集具有长期重建能力的HSCs;且这群细胞移植后6个月外周血结果提示可能具有红系和巨核分化倾向。
【图文】：

械工作台（亚泰科隆）、台式高速离心机（Eppendorf 5804R）、低-15R Beckman）、流式细胞仪（BD FACSAria Ⅱ，Calibur）、流e）、冰箱（Siemens）、静音混合器（海门市其林贝尔仪器制造有、解剖剪（HOROTEC）、解剖镊（HOROTEC）、细胞培养皿（ 孔培养板（Costar）、细胞滤膜（FALCON 40um）、注射器（广限公司）1ml。骨髓 HSCs 的痕量细胞移植整个实验过程主要包括全骨髓细胞分选，HSCs 的移植以及移植后检测等步骤(图 1-1)。

1.2.2 骨髓细胞抗体标记骨髓细胞悬液离心（310g,6 min）弃上清（以下没有特殊提到的细胞离心均为此规格），洗液洗 1-2 次，离心弃上清，，100ul1% BSA/PBS 重悬，按照抗体说明书用量，加入抗体(抗体详细信息见表 1): APC anti-CD201（EPCR）,PE-cy7Anti-CD45,APC-eFluor780 CD48, PE anti-CD150(SLAM)，4℃静音混合器避光反应30min，抗体中和液中和，离心弃上清，洗液洗 1-2 次, 200ul 1% BSA/PBS 重悬细胞，无菌细胞滤膜滤过去掉细胞团块，导入流式管中，准备流式分选。1.2.3 流式细胞仪分选 HSCs使用 Aria II (BD)进行细胞分选, 使用前调节 drop delay 使液流稳定。按照 Fig2 方式分选目的细胞（ESLAM 细胞）。收集板为 200ul 移植液/孔的 96 孔细胞培养板，每孔收 30 细胞，共收 5 孔，使用 Purity 模式分选（图 1-2）。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R457.7

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本文编号：2671635