SIRT1去乙酰化HMGB1减轻脓毒症诱导的急性肾损伤的机制研究

发布时间：2020-05-20 03:42

【摘要】：脓毒症(sepsis)是指机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍。尽管脓毒症真实的发病率仍然是未知数,保守的估计表明脓毒症是全球范围内患者死亡和危重疾病的一个主要病因。脓毒症治疗的花费巨大,2011年来自美国的数据表明,超过200亿美元(美国医院临床费用的5.2%)。急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是脓毒症发展过程中最常见的并发症之一。AKI的发病率会随脓毒症的严重程度而增加,患者出现脓毒症相关的急性肾损伤(sepsis associated acute kidney injury,SA-AKI)时病死率翻倍,明显高于其他因素导致的AKI。SA-AKI以急性肾衰竭为特征,表现为血液过滤不充分,水、电解质调节及尿液产生障碍。由于SA-AKI发病机制尚未完全阐明,目前临床对SA-AKI患者以对症支持治疗为主,因此探明SA-AKI的发病机制并以此为靶点进行药物研发具有重要的理论价值和临床意义。HMGB1是一种进化高度保守且广泛存在的蛋白,其通常作为染色质的结构蛋白而与DNA相结合。在大多数类型的细胞中,HMGB1主要存在于细胞核内参与维持核小体的形态和DNA的复制。在细胞质中的HMGB1则作为一种DAMP 分子通过和 TLR2(Toll like receptor-2)、TLR4、RAGE 和 CXCR4(chemokine receptor 4)等的相互作用激活促炎信号通路。因此,细胞受到炎症打击时可使HMGB从胞核移位到胞浆并发挥抗炎作用。有研究表明乙酰化修饰促进了 HMGB1的核浆移位,并最终促进了 HMGB1的细胞外分布。提示通过对HMGB1的去乙酰化修饰可抑制它介导的炎症反应。然而,HMGB1的去乙酰化修饰上游机制尚不明确且HMGB1介导的炎症反应是否参与了脓毒症急性肾损伤的发生发展尚未见报道。肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cell,RTEC)是肾小管的主要细胞,它参与了肾小管的重吸收、分泌和排泄等功能。缺血、感染和毒物等刺激引起RTEC损伤是肾小管功能障碍的主要因素,它们加速了 AKI的发展。然而,RTEC在SA-AKI的具体发生机制尚不明确。己知沉默信息调节因子2相关酶(Sirtuins)是一类进化中高度保守的蛋白,由SIR基因编码,属于Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶。SIRT1是酵母Sir2的哺乳动物直接同源体之一,是目前研究的最多的哺乳动物sirtuin家族成员。SIRT1在胚胎发育和骨骼肌的分化过程中扮演很重要的作用。根据具体的环境不同,SIRT1在细胞中扮演不同的作用。目前研究表明,SIRT1主要通过去乙酰化修饰某些组蛋白和非组蛋白发挥作用。目前研究证实的SIRT1的非组蛋白底物有P53、NF-1κB、PGC-lα、FOXO、liver X receptor(LXR)、PARP、Ku70、HIF-la等。我们最近研究发现,脓毒症后,小鼠肾脏组织和肾小管上皮细胞的SIRT1蛋白表达和活性下降加重SA-AKI,而SIRT1激活可以减轻SA-AKI。最近的研究也发现HMGB1也是SIRT1去乙酰化作用革靶蛋白,且SIRT1能够去乙酰化HMGB1提高内毒素小鼠的生存率。这些结果提示SIRT1减轻SA-AKI的机制可能和SIRT1去乙酰化HMGB1有关。通过上述文献的回顾,我们推测脓毒症打击导致肾小管上皮细胞的SIRT1蛋白表达和活性下降,HMGB1的核浆移位增加,HMGB1释放到胞质增加,加重了脓毒症后系统的炎症反应。因此,我们拟构建SA-AKI相关的动物和细胞模型:1、观察各处理组HMGB1的蛋白表达及核浆移位、各类炎症指标的变化、肾脏功能及脓毒症小鼠的生存时间;2、探讨SIRT1激活去乙酰化HMGB1的具体机制。通过上述研究为临床上SA-AKI的发病机制和治疗提供新的思路。第一部分 HMGB1在脓毒症小鼠血清和肾脏细胞中的表达和移位方法参照我们既往文献,复制SA-AKI小鼠模型。根据CLP的作用时间不同分为111个观察时间点:0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20h。应用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清HMGB1 的蛋白水平。应用Western Blot检测肾皮质细胞中HMGB1和SIRT1的蛋白表达,HMGB1 的核浆移位。采用免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)联合Western Blot测定HMGB1的乙酰化水平。根据我们既往研究,肾小管上皮细胞在SA-AKI发生中具有重要的作用,因此,我们通过LPS刺激的人肾小管上皮细胞(human kidney 2 cell,HK-2)构建SA-AKI相关的细胞模型。根据LPS刺激的时间不同,分为对应的观察点,检测的指标和方法和动物模型。结果1.CLP诱导的脓毒症小鼠血清HMGB1含量进行性升高,肾脏组织HMGB1含量进行性减少。2.CLP后肾脏细胞HMGB1核浆位移增多、乙酰化水平升高。第二部分干预SIRT1对HMGB1的蛋白表达、核浆移位和乙酰化水平的影响方法复制盲肠套扎穿刺(CLP)诱导的脓毒症小鼠模型及LPS刺激HK-2细胞模型。SIRT1的激动和抑制分别采用特异性的激动剂SRT1720和特异性抑制剂Ex527。动物买验分为四组:假手术(sham组)、CLP+Vehicle组、CLP+SRT1720组和CLP+EX527组。根据我们既往研究,肾小管上皮细胞在SA-AKI发生中具有重要的作用,因此,我们通过LPS刺激的人肾小管上皮细胞(human kidney 2 cell,HK-2)构建SA-AKI相关的细胞模型。细胞实验先后通过SIRT1化学激动剂和抑制剂,以及SIRT1的siRNA来证实。其中根据化学激动、抑制的处理条件不同分为对照组(Control)组、LPS+Vehicle组、LPS+SRT1720组和CLP+EX527组。针对SIRT1的干扰条件不同分别为con-siRNA组、con-siRNA+LPS组、SIRTlsiRNA组和 SIRT1siRNA+LPS组。通过Western Blot法检测SIRT1和HMGB1的蛋白表达,免疫荧光法检测HMGB1在细胞内的分布,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)法验证SIRT1和HMGB1的相互作用,使用特异性的赖氨酸位点抗体WestemBlot法探讨SIRT1去乙酰化HMGB1的赖氨酸位点。结果1.激动SIRT1使CLP诱导脓毒症小鼠肾脏HMGB1核浆位移减少,乙酰化水平降低。SIRT1抑制则结果相反。2.细胞模型证实激动和抑制(下调)SIRT1的结果和动物实验一致。3.SIRT1和HMGB1存在相互作用关系,SIRT1去乙酰化HMGB1的主要赖氨酸位点依次为K29,K28,K30。第三部分验证SIRT1去乙酰化HMGB1对脓毒症小鼠的炎症反应、肾脏病理及整体生存的影响方法复制CLP诱导的脓毒症小鼠模型,根据处理条件不同分为四组:sham组、CLP+Vehicle组、CLP+SRT1720组和CLP+EX527组。通过Western Blot法检测肾脏组织TLR2、TLR4和RAGE受体的表达,ELISA法检测血清促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-lp的含量,常规方法检测血清BUN和Cr含量,肾脏组织病理以及肾小管细胞的凋亡,观察小鼠的生存时间和72h生存率。结果1.激动SIRT1去乙酰化HMGB1可以抑制脓毒症小鼠的炎症反应。2.激动SIRT1去乙酰化HMGB1可以使脓毒症小鼠肾小管上皮细胞凋亡减少,肾功能改善,生存时间延长,生存率增加。结论1.SA-AKI相关的动物和细胞模型中HMGB1乙酰化程度增加,HMGB1核浆移位和细胞外分泌增加。2.SA-AKI相关的动物和细胞模型中,SIRT1激动可以下调HMGB1的乙酰化水平,核浆移位减少。3.SIRT1去乙酰化HMGB1的主要赖氨酸位点依次为K29,K28,K30。4.激动SIRT1能够减轻CLP诱导脓毒症小鼠的炎症反应,抑制细胞凋亡,改善肾功能,增加小鼠整体生存时间。
【图文】：

非组蛋白,组蛋白,底物,肿瘤抑制因子

ｓｉｒｔｕｉｎ。ＳＩＲＴ１在胚胎发育［７３’７４１和骨骼肌的分化［７５］过程中扮演很重要的作用。在逡逑细胞中具有很多不同的作用，包括染色质的修饰、代谢途径的表观学遗传、炎逡逑症和应激反应等［７６１邋（图２）。ＳＩＲＴ１通过结合一些组蛋白和非组蛋白底物发挥去逡逑乙酰化作用。ＳＩＲＴ１会优先的去乙酰化组蛋白的特定位点如Ｈ４Ｋ１６邋（ｌｙｓｉｎｅ邋１６邋ｏｆ逡逑ｈｉｓｔｏｎｅ邋４）、Ｈ３Ｋ９邋（ｌｙｓｉｎｅ邋９邋ｏｆ邋ｈｉｓｔｏｎｅ邋３）、Ｈ３Ｋ５６邋（ｌｙｓｉｎｅ邋５６邋ｏｆ邋ｈｉｓｔｏｎｅ邋３）邋［７７］逡逑和Ｈ１Ｋ１６邋（ｌｙｓｉｎｅ邋１６邋ｏｆ邋ｈｉｓｔｏｎｅ邋１）来促进异染色质形成和转录沉默［７８’７９］。ＳＩＲＴ１逡逑的非组蛋白底物包括且不限于：肿瘤抑制因子Ｐ５３、ＮＦ－ｋＢ、ＰＧＣ－ｌｃｔ、ＦＯＸＯ、逡逑ｌｉｖｅｒ邋Ｘ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋（ＬＸＲ）、ＰＡＲＰ、Ｋｕ７０、（ＨＩＦ）－ｌａ［６３’８０—８７］。逡逑ＥＢ－琴逡逑＿Ｌ／／邋｜、逡逑■ｓａ邋W邋Ｉ邋ｎｐ逡逑图２：邋ＳＩＲＴ１在机体和疾病中的调控作用。激动ＳＩＲＴ１可以使组蛋白和非组蛋白底物去乙酰逡逑化增加来影响多种细胞进程。（Ｐｏｕｌｏｓｅ，邋Ｎ．邋ａｎｄ邋Ｒ．邋Ｒａｊｕ，，邋Ｓｉｒｔｕｉｎ邋ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ａｇｉｎｇ邋ａｎｄ邋ｉｎｊｕｒｙ．逡逑Ｂｉｏｃｈｉｍ邋Ｂｉｏｐｈｙｓ邋Ａｃｔａ，邋２０１５．邋１８５２（１１）：邋ｐ．邋２４４２－５５．）逡逑５逡逑

路线图,实验设计,路线图

图３：实验设计的技术路线图
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R459.7

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