基于PCR-金磁微粒层析的ACE基因分型方法的建立及其在临床样本检测中的应用

发布时间：2020-05-20 19:00

【摘要】：背景:血管紧张素转换酶(ACE)基因作为高血压、心脑血管疾病的候选基因,近年来受到了广泛的关注。血管紧张素转换酶(ACE)是肾素-血管紧张素系统的重要组成部分。研究显示,ACE基因插入/缺失多态性与高血压患者的用药疗效及心脑血管疾病的遗传易感性有很大关系。因此,检测ACE基因多态性可以对不同基因型的高血压患者进行指导用药,同时还可以对心脑血管疾病进行风险预测及预防。目的:基于金磁微粒层析系统建立多样本类型ACE基因快速分型检测方法,对该方法进行系统性性能评估,结合测序及琼脂糖凝胶电泳检测方法评价该方法学的准确性及适用性;以期利用该检测方法检测高血压患者的ACE基因型并对其进行指导用药,同时利用该检测方法开展冠心病和脑卒中临床样本与该基因位点的关联分析研究,探讨ACE基因插入/缺失多态性与两者之间的关联性。方法及主要研究结果:1、针对ACE基因插入、缺失片段分别设计特异引物,对其进行筛选、标记,建立ACE基因DNA分型检测方法,对检测体系进行优化,利用测序及琼脂糖凝胶电泳分型的方法做对比进行了临床样本验证,并完成了该方法学的性能评估。该检测方法简便、快速、灵敏,完成简单的PCR扩增后层析2~5 min即可实现目视化判读。2、在ACE基因DNA分型方法建立的基础上,以全血为模板建立ACE基因全血直扩检测方法,对检测体系进行优化,利用测序及琼脂糖凝胶电泳分型的方法做对比进行了临床样本的验证,并完成了该方法学的性能评估。ACE基因全血直扩体系的建立,省去了提取核酸的繁琐步骤,避免了核酸样本提取过程中样本交叉污染的风险,整个检测过程约1小时20分,具有很大的临床应用价值。3、以健康临床样本为对照组、冠心病(CAD)和缺血性脑卒中(IS)临床样本为病例组,用建立的ACE基因分型方法进行基因型检测,对结果进行统计分析。研究结果显示,ACE等位基因和基因型频率分布在对照组与CAD组和IS组都没有显著差异。分析原因可能是冠心病和脑卒中是一种复杂的多基因疾病,需要多个相关基因位点的联合分析提供更详细的信息,为研究ACE基因多态性与脑卒中及冠心病之间遗传易感性提供临床参考依据。
【图文】：

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西北大学硕士学位论文向流的作用下会沿着硝酸纤维素膜向上层析会依次经过检测线（T lineC line）；若有扩增的目的产物存在时，PCR 扩增产物就会同时含有生这两种标记，地高辛会先与结合垫上金磁微粒偶联的地高辛单抗进行特接着标记有生物素的一端再与 T 线处的链亲和素进行结合形成复合物使析试纸条 T 线处大量聚集，，形成可目视化的红色条带，即为阳性结果。度与 PCR 扩增产生的目的产物的多少成正比，即 PCR 扩增的目的产物越越多的金磁微粒偶联的地高辛单抗，层析试纸条 T 线处的红色条带就有目的产物存在时，就不能在层析试纸条 T 线处形成红色条带，这时为析试纸条结合垫上金磁微粒偶联的地高辛单抗一般都是过量的，所以无目的产物，当层析到 C 线处时，未结合的地高辛单抗便会与 C 线处的IgG 进行结合，在 C 线处显示红色条带，所以 C 线能够保证层析系统的

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引物合成 Invitrogen Trading company全血基因组 DNA 提取试剂盒西安金磁纳米生物技术有限公司层析试纸条西安金磁纳米生物技术有限公司实验方法.3.1 测序引物的设计从 NCBI db SNP 数据库中查询 ACE 基因 17 号染色体 16 号内含子缺失位置及其近的侧翼序列并下载下来，根据文献报道[91]确定插入的具体片段和大小，以及缺失列的位置之后，用引物设计软件 Primer Premier 5.0 设计外围引物，并用 BLAST 对计的引物进行序列比对，检验引物特异性。然后把设计好的引物送由专门的公司进合成。文献中报道的具体插入序列如图 2-2 所示，设计的外围引物如表 2-1 所示。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R440

【参考文献】