分子伴侣介导自噬在甲基苯丙胺诱导的α-突触核蛋白相关神经毒性中的作用

发布时间：2020-05-21 05:19

【摘要】：研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是冰毒中最普遍滥用的苯丙胺(Amphetamine)类物质之一,大量研究表明,如果长期服用METH可破坏多巴胺能神经元末梢,还能杀死产生其他神经递质的神经细胞,产生与帕金森病(Parkinson's disease,PD)及阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD)患者类似的神经退行性病变。在METH所引起的神经毒性机制中,α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)发挥了重要作用且α-Syn的异常增多和异常聚集是其产生神经毒性的主要原因。分子伴侣介导自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)是自噬溶酶体降解途径的一员。Hsc70不仅是CMA途径传输系统中将基质蛋白输送到溶酶体腔内的关键分子伴侣,并且在神经退行性疾病的神经元死亡中也起到关键作用。Lamp2a是CMA途径的限速步骤,Lamp2a的表达水平与CMA活性水平直接相关且可以通过上调或下调Lamp2a的表达水平来调控CMA活性。已有研究表明CMA功能损坏在帕金森病的病理机制中及α-Syn的异常聚集中起到重要作用。而CMA在METH诱导的α-Syn相关病理学改变中是否起到一定的作用尚不明确。因此,本研究关注CMA与METH处理后α-Syn诱导的神经毒性之间的关系具有十分重要的意义。目的:本研究旨在阐明CMA活性水平变化与METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集及所产生的神经毒性之间的关系,探究METH对CMA途径关键分子Lamp2a和Hsc70表达水平的影响及通过调控CMA活性对METH诱导的神经毒性的影响,为METH神经毒性的分子靶向治疗研究提供一定的理论基础和研究方向。方法:1、检测METH处理后产生的毒性作用以及CMA途径关键分子Lamp2a和Hsc70表达水平的变化METH处理细胞后,检测α-Syn、pS129 α-Syn及Lammp2a、Hsc70和Lampl的表达水平。2、探究在SH-SY5Y细胞中沉默Lamp2a对CMA活性及METH诱导的神经毒性的影响用Lamp2a基因小干扰RNA(siRNA)片段并处理细胞后,检测α-Syn、pS129α-Syn、α-Syn异常聚集形式(5G4)、Lamp2a、Hsc70以及细胞凋亡水平的变化情况。3、探究在SH-SY5Y细胞中过表达Hsc70对CMA活性及METH诱导的神经毒性的影响用Hsc70基因过表达质粒并处理细胞后,检测α-Syn、pS129 α-Syn、α-Syn异常聚集形式(5G4)、Lamp2a、Hsc70以及细胞凋亡水平的变化情况。结果:1、METH诱导αα-Syn表达升高、磷酸化α-Syn表达升高并降低CMA活性。2、下调Lamp2a的表达加重了METH诱导的神经毒性,降低了CMA活性。3、上调Hsc70缓解了METH诱导的神经毒性,提高了CMA活性。结论:METH处理神经元细胞后,会使得α-Syn异常表达和异常聚集,从而产生细胞毒性促使细胞发生凋亡;同时METH会影响Lamp-2a的表达水平从而影响CMA的活性。降低Lamp-2a的表达促进了α-Syn异常表达和异常聚集,促进了细胞凋亡的发生;而对Hsc70的过表达处理使得METH诱导产生的细胞毒性得以缓解。故CMA在METH诱导的神经毒性中起到重要作用,而且Hsc70可以作为一个有效的保护分子以缓解METH导致的细胞毒性。
【图文】：

２．４邋倍和邋１＿８邋倍（ｎ＝３，ｐ＜０．０５）（图邋１－２邋Ａ，Ａ１，邋Ａ２）。在邋３．０ｍＭ邋ＭＥＴＨ邋处理邋２４邋小逡逑时的ＰＣ１２细胞中Ｌａｍｐｌ和Ｌａｍｐ２ａ的表达较对照组分别升高了约７．５倍和１．６逡逑倍（ｎ＝３，ｐ＜０．０５）（图１－２Ｃ，Ｃ１，Ｃ２）。在ｌ．ＯｍＭＭＥＴＨ处理２４小时的原代神经逡逑元细胞中Ｌａｍｐｌ和Ｌａｍｐ２ａ的表达较对照组分别升高ｆ约２．６倍和１．９倍（ｎ＝３，邋ｐ逡逑＜０．０５）（阁１－２邋Ｅ，邋Ｅｌ，邋Ｅ２）。在时间梯度中观察得到的结果与浓度梯度相符（阁１－２逡逑Ｂ，邋Ｄ，邋Ｆ，邋Ｂｌ－２，邋Ｄｌ－２，，邋Ｆ１－２）。有趣的是，无论是在浓度梯度还是时间梯度的ＭＦＴＨ逡逑处理下

３讨论逡逑ＭＥＴＨ所产生的毒性作用氧化应激损伤、谷氨酸兴奋毒性作用、线粒体功逡逑能紊乱、神经元细胞凋亡、神经胶质细胞活化和神经元退行性病变［８，９］。其中神逡逑经元退行性病变与ＰＤ和ＡＤ相类似，滥用ＭＥＴＨ者不但会产生与之类似的神逡逑经退行性改变，而且有研宄表明，长期滥用ＭＥＴＨ的人患ＰＤ的可能性也大大逡逑增高［１０－１２］。逡逑本实验运用了三种不同的细胞共同验证ＭＥＴＨ对神经系统所产生的毒性，逡逑其中ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞系神经母细胞瘤细胞，具有稳定表达络氨酸羟化酶及多巴胺逡逑转运体的特点而常被运用于ＰＤ相关的研究［４］。ＰＣ１２细胞来源于大鼠肾上腺嗜逡逑铬细胞瘤，由于主要分泌儿茶酚胺类神经递质的特点而被广泛运用于神经毒物逡逑相关损伤机制及神经退行性病变的研宄［５］。原代神经元细胞来源于Ｃ５７邋ＢＬ／６小逡逑鼠前额叶和纹状体组织，能大程度模拟体内实验情况，且有研究表明，ＭＥＴＨ作逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.64

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本文编号：2673776