激活CD11b对内毒素休克发病及相关免疫细胞活化的调控机制研究

发布时间：2020-05-22 20:44

【摘要】：目的:研究CD11b对M1型巨噬细胞极化及髓源性抑制细胞(MDSCs)募集的调控机制及其对内毒素休克发病的影响,为内毒素休克的干预和治疗提供理论依据。方法:1.用同一浓度CD11b激动剂Leukadherin-1(40μg/g,LA1)预处理C57BL/6小鼠2小时,注射不同浓度致死剂量LPS(25,37.5和50μg/g),观察小鼠死亡率;用不同浓度LA1(10,20和40μg/g)预处理小鼠2小时,注射同一浓度致死剂量LPS(37.5μg/g),观察小鼠死亡率。2.用不同浓度的LA1预处理小鼠,2小时后用LPS建立内毒素休克模型。(1)病理切片HE染色观察小鼠肝肺组织损伤情况。(2)TUNEL检测肝肺组织细胞凋亡情况。(3)流式细胞术检测M1型巨噬细胞的活化标志CD86和CD40的表达。(4)ELISA检测小鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β的含量。(5)qRT-PCR检测小鼠腹腔巨噬细胞IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1βmRNA水平的表达。3.用GM-CSF诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs),不同浓度梯度LA1处理BMDMs。通过显微镜观察细胞形态,CCK8检测细胞活力,确定合适的浓度。4.不同浓度LA1处理BMDMs 2小时,随后用LPS/IFN-γ刺激(1)流式细胞术检测BMDMs活化标志CD86和CD40的表达。(2)ELISA检测BMDMs培养上清中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β的蛋白水平表达。(3)qRT-PCR检测BMDMs中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1βmRNA水平的表达。(4)Western blot检测BMDMs中磷酸化的p38、ERK1/2、JNK和p65蛋白水平的表达。5.将未处理和LA1处理2小时的BMDMs分别回输两组小鼠,随后用LPS建立内毒素休克的模型。(1)病理切片HE观察小鼠肝肺组织损伤。(2)TUNEL检测肝肺组织细胞凋亡。(3)ELISA检测炎症因子IL-6、TNF-α和IL-12蛋白水平的表达。6.(1)LPS处理BMDMs,流式细胞术检测细胞表面TLR4和CD11b的表达。(2)LPS注射小鼠,流式细胞术检测腹腔和外周血巨噬细胞表面TLR4和CD11b的表达(3)LPS处理BMDMs,免疫荧光共聚焦观察TLR4及CD11b内化情况。7.(1)LA1处理BMDMs,流式细胞术检测细胞表面TLR4和CD11b的表达。(2)LA1注射小鼠,流式细胞术检测外周血巨噬细胞表面TLR4及CD11b的表达情况。(3)CO-IP验证TLR4与CD11b间有无相互作用。8.LA1不同时间点注射小鼠,流式细胞术检测脾脏细胞中MDSCs及其分型细胞的比例。9.LA1预处理后,流式细胞术检测内毒素休克小鼠脾脏细胞中MDSCs及其分型细胞的比例。10.用GM-CSF和IL-6体外诱导MDSCs,随后用LA1处理MDSCs。qRT-PCR检测免疫抑制相关因子IL-10、NOX-1、iNOS及Arg-1 mRNA水平的表达。结果:1.LA1可降低LPS介导的内毒素休克小鼠的死亡率。2.(1)HE显示LA1可减轻内毒素休克小鼠肝肺组织损伤。(2)LA1减轻内毒素休克小鼠肝肺组织细胞细胞凋亡。(3)LA1可降低巨噬细胞CD86和CD40的表达。(4)LA1可降低血清中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β的表达。(5)LA1可降低腹腔巨噬细胞中L-6、TNF-α、IL-12和IL-1βmRNA水平的表达。3.高浓度的LA1(≥40μM)减弱BMDMs的细胞活力,合适的浓度为20μM以下。4.(1)LA1可降低BMDMs表面CD86和CD40的表达。(2)LA1可降低BMDMs培养上清中IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β的表达。(3)LA1可降低BMDMs中TNF-α和IL-12 mRNA水平的表达。(4)LA1可降低p38、ERK1/2、JNK和p65的磷酸化水平。5.(1)回输LA1处理的BMDMs可减轻内毒素休克小鼠的肝肺组织损伤.(2)回输LA1处理的BMDMs可减轻内毒素休克小鼠肝肺组织细胞凋亡。(3)回输LA1处理的BMDMs可降低IL-6、TNF-α和IL-12蛋白水平的表达。6.(1)LPS/IFN-γ可降低BMDMs表面TLR4和CD11b的表达(2)LPS可降低小鼠腹腔和外周血巨噬细胞表面TLR4和CD11b的表达(3)LPS/IFN-γ刺激BMDMs后,免疫荧光显微镜观察到TLR4与CD11b的内化7.(1)LA1可降低BMDMs表面TLR4和CD11b的表达(2)LA1可降低外周血巨噬细胞TLR4和CD11b的表达(3)LA1处理后,免疫荧光显微镜观察到CD11b与TLR4的内化(4)CO-IP证实CD11b与TLR4之间有相互作用8.LA1可增加脾脏MDSCs及G-MDSCs的比例9.LA1增加内毒素休克小鼠脾脏MDSCs及G-MDSCs的比例10.LA1可增加MDSCs中IL-10、NOX1及iNOS mRNA水平的表达。结论:1.LA1激动CD11b可抑制信号通路蛋白p38、JNK、ERK1/2和p65磷酸化,进而抑制巨噬细胞的活化并缓解LPS介导的内毒素休克。2.LA1激动CD11b可促进MDSCs及G-MDSCs的聚集并缓解LPS介导的内毒素休克。
【图文】：

3.1 LA1 对内毒素休克的影响3.1.1 LA1 激活 CD11b 降低内毒素休克小鼠的死亡率已有研究表明 CD11b 能抑制自身免疫性疾病以及炎症性疾病的发生发展[31, 32]。在我们的研究中，我们用了一种新型小分子激动剂 LA1 激活 CD11b，探究激活 CD11b 后对内毒素休克死亡率的影响。首先，我们注射相同浓度的 LA1 预处理 C57BL/6 小鼠，2 h 后每组注射不同致死剂量的 LPS 建立内毒素休克。如图 1-A 所示， LA1 能降低不同浓度致死剂量 LPS 导致的死亡率。另外，我们通过注射不同浓度的 LA1 预处理C57BL/6 小鼠，2 h 后注射相同致死剂量的 LPS 后观察小鼠死亡率。实验结果如图 1-B所示，LA1 能够降低小鼠的死亡率，并且在一定的剂量范围内，LA1 剂量越高，效果越好。

图 2 LA1 激活 CD11b 减轻 LPS 介导的肝肺组织损伤（A,B）C57BL/6 小鼠注射 LA1（10,20和 40 μg/g），2 h 后腹腔注射 LPS（10 μg/g）。12 h 后，取肝肺组织用 4 %多聚甲醛固定，肺组织（A，×200）和肝脏组织（B，×400）做 H＆E 染色，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001（C，D）TUNEL染色法检测肺组织（C，×100）和肝脏组织（D，×200）细胞凋亡情况，，**P＜0.01。小结：（1） LA1 激活 CD11b 降低内毒素休克小鼠的死亡率；（2） LA1 减轻内毒素休克小鼠肝肺组织病理损伤情况和细胞凋亡情况。3.2 LA1 激活 CD11b 减轻 LPS 介导的炎症反应3.2.1 LA1 降低内毒素休克小鼠炎症因子蛋白水平和 mRNA 水平的表达
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R459.7

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本文编号：2676583