均相时间分辨荧光免疫分析检测降钙素原方法的建立

发布时间：2020-05-24 06:56

【摘要】：本研究成功合成出两种稀土荧光螯合剂并对通过核磁氢谱与质谱对结构进行确认,对它们的荧光性质的研究结果显示两种稀土荧光螯合剂均保持有三价铕离子的特征激发峰与发射峰,其中Eu~(3+)?bpy.bpy.py(CO_2H)_2的最大激发波长为312nm,最大发射波长为598nm和615nm,Eu~(3+)?bpy.bpy.py[CONH(CH_2)NH_2]_2的最大激发波长为311nm,最大发射波长为597nm和616nm。两种稀土螯合剂的荧光强度均与浓度呈线性相关,线性方程分别为Eu~(3+)?bpy.bpy.py(CO_2H)_2:y=310x-565.98,R~2=0.999;Eu~(3+)?bpy.bpy.py[CONH(CH_2)NH_2]_2:y=310x-1930,R~2=0.999。荧光寿命分别为1064μs与398μs;量子产率分别为10.1%与12.1%。两种稀土螯合剂的荧光性质满足时间分辨荧光免疫分析的需求。以Eu~(3+)?bpy.bpy.py[CONH(CH_2)NH_2]_2为基础进行修饰,合成并通过质谱确认得到Eu~(3+)?bpy.bpy.py[CONH(CH_2)NHCOCH_2OCH_2COOH_2]_2。最大激发波长为312nm,最大发射波长为598nm和615nm,荧光强度与浓度线性方程为y=310x-1041.4,R~2=0.999。利用DCC/NHS作为脱水剂,在DMAP的催化作用下使螯合剂与抗降钙素原检测抗体(anti-PCT detection antibody)相结合。优化标记条件后通过发现Eu~(3+)?bpy.bpy.py[CONH(CH_2)NHCOCH_2OCH_2COOH_2]_2与抗体最佳标记条件为:螯合剂与DCC/NHS的摩尔比为1:4:6,室温反应6h,与抗体蛋白以20:1的摩尔比反应10h,可以得到标记比为10的稀土荧光螯合剂标记抗体。ELISA检测结果确认标记后抗体蛋白效价为1:800。利用标记的抗降钙素原检测抗体(anti-PCT detection antibody)与抗降钙素原包被抗体(anti-PCT coating antibody)构建检测降钙素原的时间分辨免疫荧光分析方法,实验结果表明,anti-PCT coating antibody的最佳稀释比例为1:200,anti-PCT detection antibody的最佳稀释比例为1:400,最佳孵育时间为60min,在0.5~50ng/mL浓度范围内,检测荧光信号强度与抗原浓度呈线性相关,线性方程为y=2552.6x+4.8222,R~2=0.9928,灵敏度为0.5ng/mL,CV10%,重复性良好,与常见临床标志物AFP,CEA,CRP无交叉反应。
【图文】：

1.1 蒸馏 CCl41）向 CCl4中加入适量无水氯化钙，放置 3 天以上；2）将三口圆底烧瓶固定于油浴锅中，上方固定铁圆环，并插入漏斗，漏斗下底烧瓶中。漏斗中放置适当大小滤纸，滤纸边缘低于漏斗边缘；3）过滤除去 CCl4中无水氯化钙，每次过滤液体量应低于滤纸高度的 2/3；4）三口圆底烧瓶的中间口连接蒸馏头，两侧分别接温度计及加塞密封。蒸馏塞密封，侧面与直流冷凝管连接，直流冷凝管后端与连接两个单口烧瓶的三相连接。两个单口烧瓶分别用于接取馏头与馏分；5）直流冷凝管内通入流动水，油浴锅升温加热至 CCl4沸点，温度计监测烧温度；6）液体沸腾后，蒸汽在直流冷凝管中凝结流出，在一烧瓶中接取少量馏头后股尾接管，使用另一烧瓶持续接取蒸馏出的液体；7）蒸馏出的液体置于锥形瓶中，加塞，并使用封口膜密封，，干燥器中保存

将装置整体提出油浴锅，加入适量碘，有剧烈气泡产生，待反应溶液颜色逐渐变淡黄色时将装置放回油浴锅中，反应液中逐渐生成固体，并从四周开始聚集，即成的具有除水作用的乙醇镁，待生成足量乙醇镁后加入待蒸馏乙醇，回流 1h。取形冷凝管，更换直流冷凝管，操作同 2.2.1，蒸馏后收集乙醇装于锥形瓶中，加塞保存于干燥器中。2）烘干反应所需玻璃仪器，三口圆底烧瓶置于水浴中，上端与蛇形冷凝管连加塞密封，烧瓶两侧分别接温度计与 N2，烧瓶中加入 42mL 绝醇。乙醇清洗刀片去钠块表面钠，将钠切丝加入反应瓶中，产生气泡并聚集，待全部加入完毕后，水浴，反应放热致温度升高，待温度稳定后，将装置整体移入油浴锅中，加热3）温度到达 50℃时，加入对甲苯磺酰胺，提高转速，反应液呈糊状乳白色4）温度到达 78℃时，反应液沸腾回流，反应液粘稠度随温度升高而下降，反应 2h，停止反应；5）反应液抽滤，使用乙醇洗涤 3 次，得到乳白色粉末进行真空干燥。2.2.2.3 4,9-二甲苯基-4,9-二氮杂-1,2,6,7(2,6)-四吡啶环己烷的合成
【学位授予单位】：长春理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R446.6

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本文编号：2678631