联合双环发夹探针和阿霉素功能化的金纳米粒子用于MicroRNA的电化学检测

发布时间：2020-05-25 00:01

【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码的RNA分子,参与了各种生命过程中基因表达的调控。特别是在恶性肿瘤中,miRNA的表达水平与肿瘤发生发展密切相关。最近的研究发现,血液以及其他体液中也存在丰富而稳定的miRNAs。在肿瘤等病理状态下,体液中的mi RNAs表达谱与在组织细胞中一样,会发生特征性的改变。这些特定的miRNAs表达谱可构成肿瘤等疾病的“指纹”,成为一种新的无创伤性诊断标志物以助于疾病的预测、诊断和预后。目的:本研究以miRNA let-7d为目标物,通过结合基于双环发夹探针(DHP)的双链特异性核酸酶信号放大(DSNSA)策略和阿霉素功能化的金纳米粒子(AuNPs@Dox)复合材料信号放大的优点,构建一种灵敏度高、特异性强的miRNA电化学生物传感器。方法:1.电化学生物传感器的制备:联合基于双环发夹探针的双链特异性核酸酶信号放大策略和阿霉素功能化的金纳米粒子复合材料的信号放大,构建用于超灵敏检测mi RNA的电化学生物传感器。用电化学阻抗谱法(EIS)、循环伏安法(CV)、透射电镜(TEM)、Zeta分析电位法、紫外可见吸收光谱法、荧光分光光度法、琼脂糖凝胶电泳等方法对传感器的每一步构建进行表征。2.电化学生物传感器的可行性验证和实验条件的优化:对传感器的可行性进行验证。对AuNPs与Dox的体积比,MCH的浓度,捕获探针(Cp)与信号链1(S1)的杂交时间,DSN的反应时间、浓度和反应温度进行探索和优化。3.化学生物传感器的性能评估:在最优条件下,对传感器的线性范围、灵敏度、稳定性、重复性、特异性和回收实验进行分析评估。结果:1.琼脂糖凝胶电泳、荧光分光光度法验证基于双环发夹探针的双链特异性核酸酶信号放大策略的实现。透射电镜、紫外可见吸收光谱法和Zeta分析电位法表征AuNPs@Dox纳米复合材料的成功合成。电化学阻抗法和循环伏安法表征探针在电极上的修饰、杂交反应以及链置换反应的顺利进行。2.在优化条件下,对不同浓度的目标物miRNA let-7d进行检测,利用方波伏安法(SWV)分析电化学信号。在1 p M-10 nM范围内电化学信号与目标物浓度的对数呈线性相关,R~2=0.993,计算得到最低检测限为0.17 pM(S/N=3)。3.制备好的传感器在4℃保存两周后,检测信号可以保持初始信号的92.6%。用同批次的miRNA传感器对不同浓度的目标物(10 pM、50 pM和200 pM)分别重复检测3次,得到的相对标准偏差分别是4.55%、4.31%和5.03%。不同浓度的回收率为92.95 109.84%。结论:设计的多功能、无标记的DHP在DSNSA系统中表现出优异的选择性、稳定性以及对DSN的耐受性。该电化学生物传感器结合DSNSA策略和AuNPs@Dox复合材料信号放大的优点,实现了基于目标物的双重信号放大,提高了检测的灵敏度,实现了对miRNA的超灵敏、特异的检测。同时本研究中采用的新型发夹探针以及先进的纳米生物复合材料,在核酸检测以及生物传感器构建等方面具有很高的应用前景。
【图文】：

原理图,核酸酶,信号放大,双链

徊糠郑嘌喙δ堋⑽薇昙堑乃鄕贩⒓刑秸耄 HP）的设计如图1A 所示，其包含三个区域：与目标 miRNA 识别序列，输出片段（Op）及其互补序列片段。DHP 中三个区域的详细碱基情况如表 1 所示。基于 DHP 的双链特异性核酸酶信号放大（DSNSA）的原理如图 1B 所示。当目标 miRNA 存在的情况下，miRNA 与 DHP 杂交，使 DHP 的发夹结构打开形成刚性双螺旋螺旋结构。在 DSN的参与下，DHP 中的目标识别序列被水解，，而 miRNA 和 Op 片段被释放。然后释放的 miRNA 可以与新的 DHP 重新杂交引发下一个循环，同时大量积累的 Op 片段可以参与后续的反应。反之

过程图,工作电极,步骤,电极表面

1:3，v/v）活化 Au 电极表面 10 min，再用超纯水清洗干净。最后，安法（CV）在 0.1 M 的硫酸溶液中反复扫描（-0.2 V~1.6 V）Au 电极，定重复的 CV 曲线出现，取出 Au 电极用超纯水清洗干净后烘干待用。2 金电极的修饰如图 2B 所示，为了使探针更好的固定在 Au 电极表面，首先把 10 μL 的 H 滴加在预处理好的 Au 电极表面上，在室温下放置 1 h，然后用超纯水反再将 10 μL 1 mΜ 修饰有巯基的捕获探针（Capture probe，Cp）滴在 Au面上，并在4℃下孵育12 h使Cp稳定地固定在电极表面，然后用缓冲液（2-HCl）清洗去除多余的 Cp。接着，在避光的情况下，将 10 μLAuNPs@Dox到 Au 电极上，并在 37℃下放置 2 h，使 S1 与 Cp 充分杂交，然后用缓冲除去未杂交的 AuNPs@Dox@S1。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446

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