二代测序技术在人工关节感染病原菌检测中的初步应用

发布时间：2020-05-25 09:14

【摘要】：背景人工关节感染(Prosthetic joint infection,PJI)是关节置换术后难以完全避免的并发症之一。其发生率约为1%-3%,尽管发生率不高,但由于诊断困难,治疗复杂,常给病人家及社会庭带来严重的负担。及时、准确的微生物诊断是选择治疗方法的重要依据。目前,临床上依靠培养技术检出PJI治病微生物,但由于致病菌生物膜形成,培养前抗生素的使用,部分细菌培养条件苛刻、生长缓慢甚至无法培养等,导致培养阳性率不高。以PCR技术为代表的分子诊断技术常作为PJI致病微生物检测的实验室补充,可快速检出一些苛养菌,但受限于一代测序不易辨别PJI感染中的混合细菌的影响,常导致PJI混合感染致病菌的漏诊。近年来,二代测序技术(Next generation sequencing,NGS)逐步应用于感染性疾病病原菌检测,NGS的特点单次能够测大量的序列和可检出混合细菌感染,具有检出PJI混合感染中所有病原菌的潜在价值。目的探讨二代测序技术在人工关节感染微生物培养阳性关节液中病原菌检测的初步作用。方法收集2016年4月1日至2017年10月1日在我院就诊微生物培养阳性PJI患者关节液标本18例;其中,Tsukayama II/III型8例,Tsukayama IV型10例;切口渗液6例,切口无渗液12例。提取关节液总DNA,针对16S r DNA基因V3-V4区行PCR扩增,应用Illumina,Miseq平台,2 x 250 bp双端测序策略对扩增产物进行测序,测序结果与SILVA数据库进行比对,分析标本中细菌的种类及丰度。结果18例人工关节感染微生物培养关节液DNA通过16S r DNA扩增子测序(amplicon Next Generation Sequencing,a NGS)共产生5330283条高质量的序列和8449个可操作分类单元(operational taxonomic units,OTU);在细菌门水平,18个DNA样本共检测出8种不同的细菌门;在细菌属水平,共检测出34种不同的细菌属;18例DNA样本通过该技术都检测出与实验室培养阳性相一致的细菌属,其中12例DNA样本通过该技术检出实验室培养未检出的细菌;a NGS测序检出的细菌菌属种类(平均每个样本4种)显著多于实验室培养检出的细菌属种类(平均每个样本1种)(p0.01);在细菌属水平,Tsukayama II/III型和IV型平均每例样本分别检出3.4种和4.5种细菌,两组比较差别没有统计学意义(P0.05);在细菌属水平,切口渗液组平均每例检出6.33种细菌,切口无渗液组平均每例检出2.75种细菌,两组比较差别有显著性差异(p0.05)。结论在细菌属水平,a NGS技术可检出与实验室培养相一致的PJI病原菌;部分PJI病例中,还能检出实验室未培养出的细菌,但对于培养未检出的细菌是否为致病菌还需要医师结合临床做出判断;在细菌属水平,切口渗液组通过a NGS检出细菌数量高于切口无渗液组。a NGS对于混合细菌感染PJI的病原菌诊断具有一定的参考意义。
【图文】：

大肠杆菌,凝胶电泳,病例分析,平均年龄

图 1：大肠杆菌标准菌株 16S rDNAPCR 结果凝胶电泳图；M 为 Marker，1 到为大肠杆菌菌液浓度 10^8CFU/ml-10^-2CFU/ml，N 为阴性对照。2 研究病例分析根据纳入及排除标准，，排除 3 例 DNA 深度不足、3 例测序建库失败后，共18 例患者最终纳入为研究对象。依次编号为 A、B、C、D、E、F、G、H、J、K、L、M、N、O、P、Q、R，平均年龄 66.95 岁，其中 8 例为男性，10 例为女性，

曲线图,细菌门,测序,曲线图

18图 2：18 例 DNAaNGS 测序稀释性曲线图5 细菌门水平 aNGS 测序鉴定的结果在细菌门水平，对细菌相对含量大于 1%的种进行统计。18 例 DNA 样本通过aNGS 测序检出 9 个不同的细菌门，结果详见图 3。样本 A 检测出 4 种不同的细菌门，其中拟杆菌门（Bacteroidetes）占 56.43%，放线菌门（Actinobacteria）占3.15%，变形菌门（Proteobacteria）占 11.52%，厚壁菌门（Firmicutes）占 18.94%；样本 B 检测出 4 种不同的细菌门，其中厚壁菌门（Firmicutes）占 65.98%，放线菌门（Actinobacteria）占 1.63%，变形菌门（Proteobacteria）占 2.83%，拟杆菌门（Bacteroidetes）占 4.93%；样本 C 检测出 3 种不同的细菌门，分别为厚壁菌
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R687.4;R446.5

【参考文献】