蛋白基高生物兼容性磁共振纳米探针的制备及其分子成像研究

发布时间：2020-05-28 07:59

【摘要】：目的:本研究旨在通过生物矿化法制备一类以不同蛋白为模板的新型氧化钆纳米颗粒,以获得显著T_1WI磁共振增强效果、优异的肿瘤靶向性以及良好的生物兼容性。首先,拟通过模拟临床常规增强磁共振血管造影方法和剂量,探索基于近年来研究较为集中的牛血清白蛋白的氧化钆纳米颗粒(GdNPs-BSA)在中型动物模型(家兔)的磁共振血管造影成像效果,深入探讨该探针在较大动物体内的生物代谢特点、生理变化和Gd元素的体内残留量,进一步评价其临床转化前景;同时,本研究结合最新纳米技术,通过在国内外首次利用生物矿化法制备了基于人源转铁蛋白为模板的新型磁共振纳米探针(Gd@TfNPs),通过对前列腺癌荷瘤鼠模型的磁共振系列成像研究,明确该探针的高弛豫率、主动肿瘤靶向和生物可代谢等优异特点,进而有望通过本研究开发出一种更具临床转化前景的新型人源蛋白基磁共振T1增强造影剂方法:1.蛋白基新型磁共振纳米颗粒的制备。通过模拟生物矿化法制备基于牛血清蛋白的氧化钆纳米颗粒,并对其进行表征,包括利用高清晰度透射电镜、粒度分析仪对其形貌进行观察,利用紫外-可见分光光度计明确蛋白理化结构的变化,通过磁共振成像设备了解其磁共振显影性能;利用同样方法尝试制备基于人源转铁蛋白的氧化钆纳米颗粒并对其进行表征。2.进一步明确以模拟生物矿化法合成的基于牛血清蛋白的氧化钆纳米颗粒(GdNPs-BSA)在中型动物(家兔)体内的磁共振血管造影显像效能及生物相容性研究。选取4-6只家兔随机分为对照组及实验组,分别以高压静脉注射的方式给予等量的钆喷酸葡胺(Gd-DTPA)及GdNPs-BSA,观察两组家兔的背大动脉、肾动脉等大血管的显影情况,观察两组家兔分支血管的显影情况,通过病理学检查明确两种造影剂对主要组织脏器的影响,通过对血液生化指标的动态监测明确其对重要脏器功能的影响。3.明确以模拟生物矿化法合成的Gd@Tf NPs的肿瘤靶向成像能力及生物相容性。通过对Gd@Tf NPs弛豫率测定及磁共振显像实验了解其磁共振显影能力;通过细胞竞争抑制实验明确Gd@Tf NPs的体外靶向能力;通过构建TfR阳性的前列腺癌PC-3细胞的裸鼠模型,明确Gd@Tf NPs对于TfR阳性的前列腺癌肿瘤靶向显影效能;通过对鼠尾静脉注射Gd@Tf NPs小鼠的连续2周MR扫描,记录各组织器官的磁共振信号强度变化,判断Gd@Tf NPs在小鼠体内可能代谢途径;通过体外MTT实验及小鼠组织病理学检查,明确Gd@Tf NPs的体内体外毒性;通过检测小鼠2周的血液学指标及体重的动态变化,明确Gd@Tf NPs对小鼠生存状态的影响。结果:1.蛋白基新型磁共振纳米颗粒的制备。通过生物矿化法成功制备GdNPs-BSA及Gd@Tf NPs,通过高分辨力透射电镜看到两种纳米颗粒具有很好的分散性,呈小颗粒状,经粒径分析得出两种材料粒径均小于5nm,符合纳米材料的尺寸要求;通过紫外-可见分光光度计测得280nm处蛋白的特异吸收峰,说明经生物矿化法值得的氧化钆纳米颗粒保留了蛋白的固有性状,通过ICP-MS及弛豫率结果证明本课题组所合成的新型氧化钆纳米颗粒具有比传统钆喷酸葡胺(Magnevist?)更高的弛豫率(约4-5倍)。2.GdNPs-BSA的CE-MRA显影效能及生物相容性研究。通过高压注射等量Magnevist?及GdNPs-BSA于家兔体内,结果显示注射GdNPs-BSA后较Magnevist?具有更优异的血管显影效能。GdNPs-BSA具有对家兔背大动脉、锁骨下动脉、肾动脉等更好的显示能力,并且可清楚显示主动脉、肾动脉及髂动脉的分支血管,获得的图像清晰,与周围组织可形成鲜明对比。通过病理学观察显示,家兔各主要脏器内未见明显Gd离子沉积及明显细胞水平形态学变化,2周血液生化学指标监测显示,家兔注射GdNps-BSA前后重要脏器功能血液生化学数值未见明显统计学差异。3.Gd@Tf NPs的MRI成像效能及生物相容性研究。通过细胞及小鼠磁共振成像结果显示该纳米颗粒具有良好的磁共振显影效能。细胞竞争抑制试验表明了Gd@Tf NPs的体外靶向能力。通过构建的TfR阳性的前列腺癌小鼠模型,注射少量Gd@Tf NPs溶液后采集磁共振图像结果证明了Gd@Tf NPs出色的肿瘤靶向成像效果。经MTT实验证实了Gd@Tf NPs的体外低毒性,2周小鼠病理学检查未显示出Gd在重要脏器内的沉积,表明其体内的低毒性。分时连续观察注射Gd@Tf NPs后小鼠各重要脏器的磁共振信号强度变化特点,结合排泄物测定结果得出,Gd@Tf NPs大部分经肝脏摄取后经肠道随粪便排出。通过2周血液学指标的观察及体重的测量,注射Gd@Tf NPs后的小鼠各项数据基本平稳,说明Gd@Tf NPs对小鼠生存状态无明显影响。结论:1.以生物矿化法制备蛋白基纳米颗粒具有较强的可操作性及可重复性,并且其反应条件温和,最大程度保留了蛋白及金属元素的理化性质,是一种应用性极强并极具开发潜力的纳米材料合成方案。2.基于BSA的氧化钆纳米颗粒可成功通过临床血管造影方式在中型动物体内完成血管造影成像并获得良好成像效果。GdNPs-BSA有效减低了临床血管造影操作检查难度,不仅具有良好的大血管及分支血管显影效能,并且低毒,具有良好的生物相容性,可作为优选临床磁共振血管造影剂开展进一步临床转化研究。3.成功的合成了基于人源Tf的氧化钆纳米颗粒,通过各项体内体外实验证明,该纳米材料不仅显著提高了钆的弛豫率,并且成功保留了Tf的生物学功能,能有效靶向TfR高表达的肿瘤细胞及病变组织。同时,经证实,首次合成的Gd@Tf NPs不仅具有更高的稳定性,更低的毒性,并且可被肝脏特异性摄取,经肠道随粪便排出。因此,以模拟生物矿化法制备的基于人源转铁蛋白的新型氧化钆纳米颗粒不仅具有优异的肿瘤特异显像效果,并且是一种低毒、具有高度生物相容性及廓清率的新型纳米材料。综上所述,通过模拟生物矿化法制备的基于蛋白的氧化钆纳米颗粒是一类合成方法简单、具有高弛豫率、高生物相容性及廓清率的新型纳米材料,具有优异的磁共振显影效能,具有极大的临床转化价值及应用潜力。
【图文】：

分子结构图,造影剂,临床应用,商品名

出非常显著的 T1WI 强化效果[5]。阴性造影剂主要作用为缩短横向弛豫时间（t2），在磁共振 T2WI 图像上病变部分呈明显低信号改变，亦称 t2造影剂，以铁元素为主的超顺磁性物质为代表。迄今为止，在临床应用最为广泛的仍是钆类造影剂。至本文成稿前，获得美国 FDA 批准可用于临床使用的钆类造影剂主要有（1）钆喷酸葡胺（Gd-DTPA，商品名 Magnevist ）（2）钆双胺（Gd-DTPA-BMA 商品名 Omniscan ）（3）钆弗塞胺（Gd-DTPA-BMEA 商品名 OptiMARK ）（4）钆贝葡胺（Gd-BOTPA 商品名 MultiHance ）（5）钆特酸葡胺（Gd-DOTA 商品名 Dotarem ）（6）钆特醇（Gd-HP-DO3A 商品名 ProHance ）（7）钆布醇（Gd-DO3A-butrol 商品名 Gadovist ）（化学结构式见图 1）。

示意图,示意图,溶液,电感耦合等离子体发射光谱

电感耦合等离子体发射光谱-icp-oes7000 series 中国 ThermoXRD 测试仪 TIGAKU/MAX2500V/PC日本理学公司纳米粒度及 zeta 电位仪 Nano ZS 英国马尔文 1.1.2 GdNPs-BSA 的合成GdNPs-BSA 合成步骤完全按照文献报道[73]进行，反应过程见图 1.1，具体方法如下：称取 1ml 50mM Gd（NO3）3 6H2O 和 250mg 的 BSA，将 BSA 加入到 9ml高纯水，将两种溶液在 37℃下搅拌 5 分钟，，此时溶液成白色浑浊状。将 NaOH（1M，1ml）逐滴加入到混合物中，溶液逐渐变清澈。将反应溶液在 37℃下搅拌 12 小时。所得的混合溶液用 PBS 洗涤三次，10000rpm 离心 30 分钟，吸取透明上清液。使用超滤离心管以 5000rpm 进行超滤 45 分钟。以上步骤重复 3 次，得到纯化的 GdNPs-BSA。制备好的溶液 4℃保存。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R445.2

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