遗传性出血性疾病的分子诊断及基因治疗探索

发布时间：2020-05-28 13:22

【摘要】：目的:1.通过新一代测序技术、DNA微阵列技术及Sanger测序技术等方法,分析出血性疾病的分子病理,建立疑难的遗传性出血性疾病病例的分子诊断与鉴别诊断平台。本研究选取了两例疑难出血性病例进行分析:通过对一例22q11微缺失综合征患者的研究,探索影响该综合征发病的新候选致病基因及分子病理,以深化我们对22q11微缺失综合征的认识;通过对一例血红蛋白Hornchurch并发血小板减少症患者的研究,探索血红蛋白Hornchurch的实验室及临床特征。2.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立遗传性出血性疾病模型,并进行基因治疗的初步探索,希望能够为单基因遗传性疾病的基因治疗提供新策略。采用CRISPR/Cas9技术建立罕见病α1-抗胰蛋白酶Pittsburgh突变的细胞模型,为下一步的基因治疗奠定基础。方法:1.收集于2015-2017年间在苏州大学附属第一医院血液科门诊未获得明确诊断的出血性疾病患者标本,采用基因测序技术进行基因诊断,并对确诊患者进行临床及实验室特征分析和总结。2.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立α1-抗胰蛋白酶Pittsburgh突变的细胞模型,并采用实时荧光定量PCR技术(q-PCR)和蛋白质免疫印迹技术(Western Blot,WB)检测α1-抗胰蛋白酶在m RNA和蛋白质水平上的表达情况。结果:1.22q11微缺失综合征发病的新候选致病基因筛选通过应用微阵列分析技术对1例22q11微缺失综合征患者进行检测,发现了长度为125kb的基因片段缺失(染色体22:24276973-24402263),涉及8个基因:GSTT2B、GSTT2、DDTL、DDT、GSTTP1、LOC391322、GSTT1和GSTTP2。以上基因不在已报道的致病位点中,它们可能参与第三和第四咽弓的发育,也可能参与调控22q11DS的已知致病基因。2.血红蛋白Hornchurch患者的临床及实验室特征通过对血红蛋白基因测序诊断1例血红蛋白Hornchurch患者,我们对其临床及实验室特征进行了分析和总结。该例患者表现为异丙醇沉淀试验阳性,表明血红蛋白Hornchurch的结构异常和功能特性的关系需要进一步研究。另一方面,这提示中国人群中可能存在更多待发现的血红蛋白变异体及其携带者。3.α1-抗胰蛋白酶Pittsburgh突变的细胞模型建立我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功建立了α1-抗胰蛋白酶Pittsburgh突变的细胞模型。结论:1.本研究通过对诊断未明的出血性疾病病例进行基因诊断,确诊了数例罕见出血性疾病并分析了相应临床特点及实验室特征,同时揭示了基因测序在遗传性出血性疾病诊断中的重要作用。2.应用微阵列分析技术发现了22q11微缺失综合征的8个可能的新致病基因:GSTT2B、GSTT2、DDTL、DDT、GSTTP1、LOC391322、GSTT1和GSTTP2。我们发现了血红蛋白Hornchurch患者的异丙醇沉淀实验阳性,提示血红蛋白Hornchurch结构的不稳定性,同时表明中国人群中可能存在更多的血红蛋白变异体及其携带者。3.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功建立了α1-抗胰蛋白酶Pittsburgh突变细胞模型,为后续基因治疗研究奠定了基础。
【图文】：

超声心动图,时间表,反复呼吸道感染,病史

3图 1. 微阵列分析揭示长度为 125kb 的基因片段缺失（染色体 22 ：24276973-24402263），涉及8个基因：GSTT2B、GSTT2、DDTL、DDT、GSTTP1、LOC391322、GSTT1和GSTTP2表 1. 患者病史的时间表日期诊治摘要实验室检查干预2005 反复呼吸道感染; 诊断：先天性房间隔缺损超声心动图：房间隔缺损手术修复2006 颈部、下颌下淋巴结肿大内窥镜：扁桃体肥大扁桃体切除术2013 反复呼吸道感染纤维支气管镜：气管狭窄气管淋巴结摘除2014.7 打鼾和张口呼吸; 诊多导睡眠图：呼吸暂停淋巴结清扫，枕部脂

杂合,密码子,患者,序列分析

蛋白：118 g/L，网织红细胞计数：36×10/L，平均红细胞体积：94.2 fL，红细胞分宽度：13.5％和血小板计数 62×109/L。白细胞计数在正常范围内。肝功能显示总胆素、直接胆红素和间接胆红素水平正常。溶血试验显示异丙醇沉淀试验阳性。H和 HbA2分别为 7.3％（正常范围 0.2-1.2％）和3.6％（正常范围 2.3-3.3％）。直接 Coom试验、红细胞渗透脆性试验、G-6-PD 荧光斑点试验、Ham 试验和蔗糖溶血试验均阴性。高效液相色谱分析表明变异体血红蛋白在 S 窗中洗脱，百分比为 43.1％。HB基因测序发现 E44K（G>A）突变（图 1）。另方面，，患者网织血小板百分比和血板相关免疫球蛋白 G（PAIgG）分别为 9.8％（正常范围 12.5±4.15％）和 43.4％（常范围 35.6±7.4％）。单克隆抗体特异性固定血小板抗原术显示抗 GPⅡb 抗体阳性综合以上结果，患者被诊断为异常血红蛋白病（Hb Hornchurch）合并血小板减少症我们给予患者环孢菌素 A（75 mg，bid），利可君（20mg，tid）和左旋咪唑（25mgtid，3d/w）治疗 3 个月。治疗过程中患者未发生出血。至 2017 年 4 月底，患者血蛋白水平和血小板计数已经恢复到 124g/L 和 66×109/L。（表 1）
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R554;R450

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