腺相关病毒介导hVEGF165基因和SDF-1基因共转染小鼠内皮祖细胞的实验研究

发布时间：2020-05-31 07:37

【摘要】：目的:检测腺相关病毒介导hVEGF165和SDF-1基因共转染小鼠EPCs后mRNA及蛋白质的表达水平。方法:首先利用基因重组技术构建CAG-VEGF165-T2A-mcherry-WPRE和pHBAAV-tfeb-MCS-3flag-T2A-ZsGreen的AAV重组质粒,经酶切及测序鉴定后转染293T细胞,Western Blot检测hVEGF165蛋白及SDF-1蛋白表达。在分离和培养EPCs后通过免疫组织化学分析VIII因子、KDR、CD34和CD31的表达,通过流式细胞术比较CD34在单个核细胞和培养7天的贴壁细胞的表达,以及细胞摄取Dil-Ac-LDL及结合FITC-UEA-1能力。AAV-hVEGF165与AAV-SDF-1共转染EPCs,Western Blot检测hVEGF165蛋白及SDF-1蛋白表达,并用MTT法检测hVEGF165及SDF-1共转染EPCs后对其增殖的影响。结果:经酶切鉴定及基因测序证实和预期的目的基因序列基本一致,Western Blot显示hVEGF165蛋白及SDF-1蛋白有很好的过表达,具有生物学功能的AAV-hVEGF165与AAV-SDF-1构建成功。EPCs分离培养后,免疫组化显示VIII因子、KDR、CD34和CD31成功表达,流式细胞术结果显示空白组几乎不表达CD34+,刚分离出的单个核细胞组有少量细胞表达CD34+,而培养7天后的细胞大量表达CD34+。荧光显微镜观察Dil-Ac-LDL及FITC-UEA-1在原代培养的EPCs中的摄取和结合能力显示,大多数细胞都是双阳性并且符合EPCs特征。MTT法显示hVEGF165和SDF-1对EPCs的增殖具有促进作用,Western Blot显示hVEGF65和SDF-1在EPCs中表达,AAV-hVEGF165与AAV-SDF-1共转染EPCs其表达量明显多于AAV-hVEGF165与AAV-SDF-1各自单独转染的EPCs。结论:hVEGF165基因和SDF-1基因共转染小鼠EPCs可明显增加其在EPCs的表达量。
【图文】：

第 3 章 结果3.1 腺相关病毒载体的构建和鉴定3.1.1AAV-SDF-1 及 AAV-hVEGF165 载体的构建及鉴定结果单克隆 PCR 为阳性，PCR 鉴定是使用的的引物为载体上的常规引物，，故得出的结果中实际的条带大小比理论的条带大小多 300 bp 左右。阳性克隆的测序显示其与预期的目的基因序列基本一致，表明成功构建 pHBAAV-tfeb-MCS-3flag-T2A-ZsGreen 载体。菌落 PCR 鉴定后得到阳性克隆为 1547bp 的片段即为含 VEGF165 的基因，阴性克隆得到 0bp 的片段。将构建的重组载体进行阳性克隆测序，测序结果和预期的目的基因序列一致，表明成功构建 CAG-VEGF165-T2A-mcherry-WPRE载体。（图 1）

图 2 AAV-hVEGF165 转染 293T 细胞免疫荧光及 Western Blot3.2 小鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞分离制备及其鉴定3.2.1 体外培养 EPCs 的形态学特征原代分离出的细胞体积较小，呈大小不等的圆形，第 2-3 天开始出现梭形细胞，随后梭形细胞逐日增多，聚集成簇，于第 12 天出现铺路石样外观（图 3）。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R459.7

【参考文献】

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本文编号：2689521