【摘要】：研究目的第一部分:早期复苏后高乳酸血症的感染性休克患者,联合ScVO2和PI评估乳酸清除和心肌损伤的关系。第二部分:线粒体自噬和脓毒症不同时期心肌损伤的关系。第三部分:探讨LAMP2介导的线粒体自噬溶酶体途径在脓毒症心肌损伤过程中自噬、凋亡与能量代谢的关系。研究方法第一部分:回顾性收集2013年8月-2016年7月北京协和医院重症医学科收治的脓毒症休克患者,按照常规血流动力学管理流程,入科6h内达到复苏目标(EGDT),入选完成EGDT时动脉血乳酸2mmoL/L的患者,根据Scv02和脉搏氧灌注指数(PI)将患者分为4组,ScvO280%和PI1.4组(A组)、ScvO280%和PI1.4 组(B 组)、ScvO280%和 PI1.4 组(C 组)、ScvO2800%和 PI1.4 组(D 组)。收集患者一般资料,入科时APACHE II和SOFA,临床血流动力学参数,组织灌注指标及患者完成复苏时、2h、4h、6h动脉血乳酸水平。采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析。第二部分:40只SD大鼠,按随机数字表法随机分成4组(每组10只):假手术组(SAM组)、脓毒症6h组(CLP6h组)、脓毒症12h组(CLP12h组)、脓毒症18h组(CLP18h组)。SAM组于术后18h,CLP三组分别于术后6h、12h、18h麻醉开胸,采血及心脏标本,以备cTnI,电镜切片,免疫荧光染色及Lc3-II、Lamp2等基因mRNA及Western Blot检测。评估线粒体自噬在脓毒症不同时期心肌损伤的作用。第三部分:40只SD大鼠随机分为4组(每组10只):假手术组(SAM组)、假手术+巴弗洛霉素组(SAM+Baf-A1组)、脓毒症组(CLP组)、脓毒症+巴弗洛霉素组(CLP+ Baf-A1组)。SAM+ Baf-A1组和CLP+ Baf-A1组分别在假手术和CLP手术造模后1h给予Baf-A1 0.3 mg/kg腹腔内注射,SAM组和CLP组接受同等剂量Baf-A1溶剂DMSO。四组大鼠18h后采血及心脏标本,以备cTnl,电镜切片,免疫荧光染色,TUNEL染色及心肌Lc3-Ⅱ、Lamp2、Bik等基因mRNA及Western Blot检测。给予自噬抑制剂,检测心肌细胞凋亡情况,明确自噬和凋亡在脓毒症心肌功能障碍发生发展中的作用及相互关系。研究结果第一部分:(1)C组患者完成早期复苏2h、4h、6h的乳酸清除率分别为34.57(21.44,44.20)%,58.33(30.19,70.79)%,71.43(53.75,82.79)%(2入 ICU24h,B组患者肌钙蛋白升高的发生率最高(85.0%),A组最低(45.7%),差异有统计学意义(P0.008);入ICU72h,C组患者肌钙蛋白升高的发生率最低(29.3%),B组最高(70%),差异有统计学意义(P0.008)。(3)logistics回归分析显示,B组4h乳酸清除率与入ICU48h和72h心肌损害发生率相关(OR=0.917,95%CI0.851～0.988;OR=0.920,95%CI 0.854～0.992)。(4)4 组患者 ICU留治时间、28d病死率差异无统计学意义(P0.05)。第二部分:(1)CLP术后6h、12h和18h大鼠血清中cTnI逐渐升高,四组间两两比较差异均有统计学意义(all P=0.000);(2)CLP6h组LC3-Ⅱ mRNA表达高于SAM组及 CLP18h 组(P 均=0.000);CLP12h 组 LC3-IImRNA 高于 SAM 组(P=0.028);SAM 组心肌 LC3-Ⅱ 蛋白水平低于 CLP6h 组(P=0.001)、CLP12h 组(P=0.002)及CLP18h组(P=0.000)。(3)CLP6h组大鼠心肌Atg5mRNA水平高高于SAM组(P=0.002)、CLP12h 组(P=0.012)及 CLP18h 组(P=0.009)。(4)Lamp2mRNA 在CLP6h 即达高峰,高于 CLP18h 组(P=0.037)。第三部分:(1)CLP+ Baf-A1 组 cTnl 大于 CLP 组(P=0.000),SAM+ Baf-A1 组cTnl大于SAM组(P=0.002)。(2)CLP+ Baf-A1组细胞凋亡指数高于CLP组(P=0.001);CLP组细胞凋亡指数高于SAM组(P=0.013)。(3)CLP组LC3-II蛋白水平高于SAM组和 SAM+Baf-A1 组(P=0.000,P=0.007);CLP+Baf-A1 组高于 SAM+Baf-A1 组,均值比较差别均具有统计学意义(P=0.024);CLP+ Baf-A1组和CLP组比较均值差异无统计学意义(P=0.270)。(4)CLP+ Baf-A1组BIK蛋白水平高于CLP组(P=0.028);CLP 组高于 SAM 组(P=0.000)(5)四组大鼠心肌中 CLP 组 Lamp2 mRNA水平最高,高于 CLP+ Baf-A1 组((P=0.038)),高于 SAM 组(P=0.06);CLP组 Lamp2 蛋白水平高于 SAM 组(P=0.000)和 CLP+ Baf-A1 组(P=0.009)。(6)CLP+Baf-A1 组 ATP 水平低于 CLP 组(P=0.032);CLP 组 ATP 水平低于 SAM 组(P=0.022)。结论:第一部分:1.感染性休克患者早期复苏后乳酸持续未清除与微循环障碍及细胞功能障碍相关;2.早期复苏后乳酸清除较慢的感染性休克患者易于发生心肌损伤;3.感染性休克患者早期复苏后,微循环障碍和细胞功能障碍同时出现时心肌损伤程度最重,且心肌损伤发病率最高;4.感染性休克患者早期复苏后微循环被纠正时仍可独立出现细胞功能障碍及伴随出现心肌损伤。第二部分:1.脓毒症不同时期心肌细胞线粒体自噬水平不同,表现为早期升高,晚期下降;2.脓毒症晚期出现LC3-II基因和蛋白表达不一致,可能与LAMP-2表达下降导致自噬蛋白降解缓慢相关;3.脓毒症晚期自噬体清除缓慢与心肌细胞线粒体损伤相关;4.脓毒症时线粒体损伤程度和心肌损伤程度相关;第三部分:1.抑制溶酶体膜蛋白LAMP-2的表达,可导致自噬标志蛋白LC3-II进一步升高,验证晚期线粒体LC3-II基因和蛋白表达不匹配现象与自噬蛋白清除缓慢相关;2.抑制脓毒症大鼠心肌LAMP-2的表达,导致自噬体降解缓慢,出现凋亡基因BIK表达,上调凋亡水平;3.脓毒症时,LAMP-2是调节凋亡基因BIK表达的潜在干预位点。
【图文】：
图７．注：＊为与ＣＬＰ６ｈ组比较Ｐ＜０．０５；逡逑
图８．注：＊为与ＣＬＰ６ｈ组比较Ｐ＜０．０５；逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7
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2690890
