降钙素原单克隆抗体的制备及其生物传感器的初步研究

发布时间：2020-06-01 23:36

【摘要】：降钙素原(procalcitonin,PCT)因其具有高度敏感性和特异性,在临床中已作为细菌性感染和病毒性感染的鉴别诊断指标。目前PCT的检测方法有多种,主要包括放射免疫分析法、投射免疫浊度法、化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附法和胶体金比色法等,虽然这些方法具有准确、灵敏、特异性高等优点,但所需试剂大部分依赖于进口,且所需仪器价格昂贵、操作程序繁琐等原因。因此,开发一种简便、准确、低成本的PCT检测方法,是目前临床检验医学亟待解决的问题。极大角度光纤光栅(excessively tilted fiber grating,Ex-TFG)免疫传感器具有检测灵敏度高、特异性好、免标记、设备便携、成本低的优点,具备临床检测潜力。前期本实验室已成功将Ex-TFG免疫传感器应用于心力衰竭生物标记物N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、猪圆环病毒2型(PCV2)、以及新城疫病毒(NDV)的检测。本文拟采用大肠杆菌原核表达系统制备PCT蛋白,并以此抗原免疫BALB/c小鼠,采用PEG1500细胞融合技术制备单克隆抗体;基于金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcus Aureus Protein A,SPA)与IgG型抗体特异性结合的原理,先用SPA修饰光纤光栅传感器表面,再利用SPA将极高特异性PCT单克隆抗体固定在Ex-TFG表面,对PCT进行特异性的结合,从而初步建立一种基于Ex-TFG的PCT免疫传感器,为PCT的临床检测提供新的方法。本文的研究内容如下:1.采用了基因工程方法对PCT蛋白的原核表达进行了研究,对PCT的编码基因序列进行优化,通过化学方法合成优化后PCT基因,并将其连接至pET28a(+)载体,构建重组质粒pET28a(+)-PCT。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中,采用IPTG诱导重组蛋白的表达,设置了诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间三个影响因素,筛选出最佳诱导条件大量表达重组PCT蛋白。利用Ni柱亲和层析法纯化诱导所得重组PCT蛋白,并分别采用二喹啉甲酸(BCA)法、SDS-PAGE电泳、Western blot对重组PCT蛋白进行浓度、纯度、及特异性鉴定。2.将制备的重组PCT蛋白采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的小鼠脾脏制成脾细胞悬液,然后与骨髓瘤细胞混合,以PEG1500作为诱导剂进行细胞融合,建立间接ELISA法对融合后的杂交瘤细胞进行筛选,将筛选到的阳性孔进行至少2次以上的亚克隆,最终获得单克隆阳性杂交瘤细胞,制备单抗腹水,先使用辛酸硫酸法初步纯化小鼠腹水,再采用Protein A柱纯化,对纯化后的单克隆抗体进行生物特性鉴定。3.对极大角度光纤光栅进行表面化修饰,依次使用浓H_2SO_4进行表面羟基化修饰、APTES进行硅烷化修饰以及SPA修饰光纤光栅传感器表面,然后SPA与PCT单克隆抗体结合,用于PCT的检测,并对传感器的稳定性、重复性、临床性以及特异性进行评定。结果:1.重组大肠杆菌工程菌在25℃,0.5mM IPTG,摇床转速为150rpm诱导12h,PCT蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示:经镍柱亲和层析纯化所得PCT蛋白纯度达到了90%以上,Western blot显示在17KD处有明显的蛋白印迹条带,与预期设想的蛋白分子量相符,表明成功实现了PCT蛋白在大肠杆菌高效表达。2.制备PCT单克隆抗体时,共进行了二次细胞融合,融合率分别为79.69%和60.41%,阳性率分别为4.17%和16.88%。经2次亚克隆反复筛选共获得了2株能稳定分泌抗PCT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为8D3和10F9;2株杂交瘤细胞株经反复冻存、复苏及多次传代,均能分泌高效价抗体,8D3为IgG2b型抗体,10F9为IgG1型抗体;Western-blot证实所获得单抗是特异性针对PCT;制备了腹水抗体并使用ProteinA柱进行纯化,纯化后抗体纯度达到了90%以上,选取同一批次纯化所得峰值最高的收集液,使用BCA法测得其浓度分别为1.178 mg/mL、1.617 mg/mL、1.094 mg/m L。3.光纤光栅经过羟基化,硅烷化,SPA固定以及结合PCT抗体处理后,检测各个表面化修饰的光谱图,结果显示:羟基化、硅烷化、SPA固定以及结合PCT抗体的谐振波长偏移量分别为:0.015nm、0.08nm、0.094nm以及1.008nm,表明各步修饰成功进行。该免疫传感器检测PCT的最低极限为0.5ng/mL,最高检测极限是1000ng/mL,三次重复性实验检测结果基本一致显示传感器的重复性良好,可重复使用,特异性实验结果显示检测只能特异性识别PCT抗原,传感器特异性良好,临床性结果显示能够检测出患者血清中的PCT,传感器的临床性良好。结论:本实验通过对PCT原核表达进行研究,获得了特异性好,纯度高的PCT重组蛋白,经细胞融合、筛选、亚克隆后得到2株能够稳定分泌PCT单克隆抗体的杂交瘤细胞株。使用制备的PCT抗原、抗体初步建立了基于Ex-TFG的PCT免疫传感器,该传感器具有检测灵敏度高、实验重复性好、检测特异性强、以及可完成样品实时定量检测的优点,为降钙素原的临床检测奠定了基础。
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.6

【参考文献】