STEC O157三重荧光定量PCR检测方法的建立及对江苏某地区部分牛场粪便样品的临床检测
发布时间：2020-06-03 21:36
【摘要】：产志贺氏毒素大肠杆菌(STEC)是一类肠道病原体的总称,可以在全球范围内引起局部地区零散的感染和广泛的地区疾病爆发。STEC O157作为一种产志贺氏毒素大肠杆菌,可以在人体宿主内引起胃肠道疾病,如出血性结肠炎(血性腹泻)和溶血性尿毒综合征(HUS),其发病率和死亡率都很高。STEC O157通过粪口途径传播,一旦进入人体会在大肠中增殖,产生毒素并发挥毒力效应而致病。常规检测方法有分离培养、生化鉴定及血清型鉴定等,检测过程复杂且耗费时间,故近年来针对STEC O157的荧光定量PCR检测方法陆续发展起来,然而这些方法大多是对其单个基因来进行检测,如果所选择的毒力靶基因缺失则会导致出现假阴性结果。值得注意的是,一些毒力基因并非STEC O157特有,也存在于最常见的6种非O157型STEC(026,045,0103,0111,0121,0145)当中,故被检测为阳性的样品需要进一步试验以确认血清型,无法达到快速检测的目的。因此,需要建立一种快速、准确的多重荧光定量PCR检测方法。STEC O157最常见的毒力相关基因包括hlyA、eaeA、stx2、rfbE和fliCH7,本研究选择其rfbE、stx2、eae为靶基因,建立三重荧光定量PCR检测方法,同时对该方法展开特异性、灵敏性及重复性实验分析,综合评估该方法对STEC O157的检测效力,并应用于江苏某地区牛场的牛粪样品中STEC O157病原的检测,建立STEC O157的临床检测手段。1 STEC O157三重荧光定量PCR检测方法的建立本研究选择STEC O157的高特异性O抗原基因rfbE,与大多数O157菌株都具有的stx2、eae两个毒力基因进行组合,建立三重荧光定量PCR检测方法。首先开展了特异性实验,结果显示只有存在以上三个基因的大肠杆菌O157:H7产生三条扩增曲线,大肠杆菌026、K88ac、BL21、DH5α、鼠伤寒沙门氏菌W32、肠炎沙门氏菌C50336菌株以及阴性对照和空白对照组均无法产生三条扩增曲线,说明该方法特异性强。其次通过灵敏性实验,分析了rfbE、stx2、eae三个基因各自的检测灵敏度,结果表明菌液浓度为101CFU/mL时三个基因均产生扩增曲线,该方法的最低检出限为101CFU/mL,灵敏度较高。最后开展了重复性实验,结果表明在同一菌液浓度下,三组平行组间rfbE、stx2、eae三个基因各自的Ct值相差不超过1,说明反应中各基因的Ct值较为稳定,该方法重复性好。总之,基于以上实验分析,本研究成功建立了用于快速检测STEC O157的三重荧光定量PCR方法,为后续对江苏某地区部分牛场粪便样品进行临床检测奠定了基础。2对江苏某地区部分牛场粪便样品的临床检测本次对牛粪便中STEC O157病原的临床检测针对江苏扬州地区两个不同的牛场来进行,以便了解不同牛群的带菌情况和该地区整体的STEC O157流行分布情况。扬大农牧牛场和江都荷龙牛场各250份牛粪样品的检测结果表明:扬大农牧牛场中STEC O157的阳性检出率为2.4%,而江都荷龙牛场中STEC O157的阳性检出率为0%。总之,扬州地区的STEC O157分布是不均衡的。此外,在对总共500份牛粪样品的检测结果的分析中也发现,尽管所有样品中STEC O157的阳性检出率仅为1.2%,但仍然有许多样品在三重荧光定量PCR检测过程中出现了s x2和eae两个基因的扩增曲线,这说明样品中可能存在其他类型的大肠杆菌或是非O157型STEC。综上所述,本实验建立的三重荧光定量PCR在针对STEC O157进行检测的同时,也可以分析其他类型的大肠杆菌以及非O157型STEC的流行分布情况。本研究将经三重荧光定量PCR检测出的6份阳性样品进行传统PCR检测,发现两种方法的检测效力存在显著差异。传统PCR仅检测出1份阳性结果,这表明三重荧光定量PCR的阳性检出率更高,为牛粪中STEC O157病原的有效检测手段。
【图文】：
Ａ：_灒寤蚶┰銮咤义匣蚶┰銮咤义希茫剩Γ不蚶┰銮咤义希疲椋纾欤戾澹瘢校茫义澹妫铮蝈澹牛悖铮欤殄澹希欤担罚海龋峰澹螅簦颍幔椋铄义希粒哄澹瘢校茫义澹妫铮蝈澹簦瑁邋澹澹幔邋澹纾澹睿邋义希拢哄澹瘢校茫义澹妫铮蝈澹簦瑁邋澹颍妫猓佩澹纾澹睿邋义希茫哄澹瘢校茫义澹妫铮蝈澹簦瑁邋澹螅簦插澹纾澹睿邋义，
本文编号：2695435
【图文】：
Ａ：_灒寤蚶┰銮咤义匣蚶┰銮咤义希茫剩Γ不蚶┰銮咤义希疲椋纾欤戾澹瘢校茫义澹妫铮蝈澹牛悖铮欤殄澹希欤担罚海龋峰澹螅簦颍幔椋铄义希粒哄澹瘢校茫义澹妫铮蝈澹簦瑁邋澹澹幔邋澹纾澹睿邋义希拢哄澹瘢校茫义澹妫铮蝈澹簦瑁邋澹颍妫猓佩澹纾澹睿邋义希茫哄澹瘢校茫义澹妫铮蝈澹簦瑁邋澹螅簦插澹纾澹睿邋义，
本文编号：2695435
本文链接：https://www.wllwen.com/linchuangyixuelunwen/2695435.html
最近更新
教材专著
