SHV型β-内酰胺酶在革兰阴性杆菌中的分子特征及进化研究

发布时间：2020-06-03 20:10

【摘要】：背景与目的革兰阴性菌感染与检出率的增加,以及抗菌药物在临床上的不合理使用、滥用,使得耐药菌株乃至多重耐药菌株不断涌现,临床抗感染治疗面临着严峻的考验。β-内酰胺类抗菌药物作为抗菌治疗的重要手段,因而在临床上已被广泛应用。然而,耐药菌株尤其是超广谱β-内酰胺酶携带菌株的出现,为预防与控制耐药菌株的传播和流行带来了更大的挑战。SHV型β-内酰胺酶作为早期发现的β-内酰胺酶代表型别之一,其耐药基因多由质粒介导传播,少数定位于染色体上。自1983年在德国报道了首例SHV型ESBL以来,SHV型超广谱β-内酰胺酶逐渐增多,在部分地区已经成为革兰阴性杆菌中检出率最高的型别。该酶型先后曾在欧洲、南美、亚洲、非洲等世界范围内广泛传播流行,尤以亚洲地区显著。全球范围内已被公布的SHV型β-内酰胺酶变异体已达180多种,且在医院获得性或社区感染性微生物中广泛传播。目前,SHV型β-内酰胺酶虽未如CTX-M型ESBLs呈现出爆发式的流行传播,但其在临床典型宿主肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌以外的其他菌属中已被逐渐检出,基因变异频率不断上升,且在不同的临床环境中均有发现。目前,有关革兰阴性杆菌中β-内酰胺酶的分子进化研究已经成为国际临床微生物学领域的研究热点之一。生物信息学的运用为基因分子进化研究提供了实用工具,加之测序技术的最新进展为我们提供了大量有关微生物基因组的可用数据,因此,通过序列之间的分析比对、系统进化树的构建、潜在正选择位点的检测及蛋白质水解酶的三维空间结构分析等手段,我们能够迅速得出SHV型β-内酰胺酶的分子进化路径,从而为了解耐药基因的传播与流行、探寻耐药基因的进化起源及动力学、分析SHV型β-内酰胺酶的潜在进化可能性提供更精准的理论支持。SHV型β-内酰胺酶的分布特征存在地域性差异,不同国家乃至同一国家的不同地域,SHV型β-内酰胺酶的流行情况有所不同,因此,仅依据部分地区来源数据进行生物信息学分析得出的进化路径结果,存在的一定的误差。而以耐药史及临床数据资料为基础建立的分子进化路径,才能尽可能地还原抗菌药物选择压力下临床微环境的改变状况,从而保证结果的可信度。为此,本课题探究了SHV型β-内酰胺酶的临床耐药特点及流行分布情况,并构建SHV型β-内酰胺酶的分子进化路径,旨在明确抗菌药物作用下耐药基因的起源、发展及遗传分子特征,为临床抗菌治疗提供理论支持,为抗菌药物的规范、合理使用提供实验室依据。方法1.菌株收集收集2016年7月至12月间,郑州大学第一附属医院细菌室分离的耐第三代、四代头孢菌素类抗菌药物的非重复革兰阴性杆菌374株。所有菌株均采用VITEKⅡCompact全自动微生物鉴定仪鉴定到种。2.抗菌药物敏感试验与ESBL表型确证试验药敏结果与表型确证结果参照CLSI 2015标准进行判读分析。3.耐药基因的PCR扩增及基因亚型鉴定采用PCR试验扩增目的基因及其他常见耐药基因,琼脂糖凝胶电泳并测序鉴定基因亚型。4.ERIC-PCR菌株同源性分析采用ERIC-PCR分析SHV型β-内酰胺酶阳性携带菌株同源性。5.SHV型β-内酰胺酶的进化分析采用序列比对、系统进化树构建等生物信息学方法分析SHV型β-内酰胺酶的分子进化路径。6.SHV型β-内酰胺酶的三维构象分析采用正选择位点检测、蛋白质构象构建等生物信息学方法分析SHV型β-内酰胺酶中氨基酸位点的结构-功能关系。结果1.Bla_(SHV)阳性携带菌株的检出分布情况374株革兰阴性杆菌中共检出67株bla_(SHV)阳性携带菌株,以肠杆菌科细菌为主,其中肺炎克雷伯菌61株(91.04%),大肠埃希菌2株(2.99%),阴沟肠杆菌1株(1.49%),臭鼻克雷伯菌1株(1.49%),弗劳地柠檬酸杆菌1株(1.49%);非发酵菌1株(1.49%),为鲍曼不动杆菌。2.常见耐药基因的携带情况共检出12种SHV型β-内酰胺酶基因亚型,分别为SHV-1、SHV-2、SHV-2a、SHV-11、SHV-12、SHV-27、SHV-31、SHV-33、SHV-41、SHV-61、SHV-71和SHV-190。多数菌株同时携带其他型别耐药基因,其中TEM型39株,CTX-M-1组11株,CTX-M-9组25株,OXA-1组4株,KPC型16株,NDM型7株。3.菌株的同源性分析结果61株肺炎克雷伯菌株显示出56种不同的DNA图谱分型,其中8株肺炎克雷伯菌株存在菌株的同源情况,表现出3种不同的ERIC-PCR分型结果。2株大肠埃希菌与其他菌株的ERIC-PCR结果显示均不同源。4.SHV型β-内酰胺酶的进化路径本研究发现SHV-11→SHV-2a/SHV-31→SHV-12的多元进化路径,且路径中第238位和第240位氨基酸位点为正选择位点,位点所在酶蛋白结构变化影响SHV型β-内酰胺酶的水解活性。结论1.本地区SHV型β-内酰胺酶主要存在于肠杆菌科细菌中,首次在臭鼻克雷伯菌、弗劳地柠檬酸杆菌和鲍曼不动杆菌中发现,提示SHV型β-内酰胺酶的宿主菌谱有拓宽趋势。2.SHV-12为最流行的ESBL酶型,SHV-61型及SHV-190型β-内酰胺酶为河南地区首次报道检出,且单一菌株存在同时携带两种及以上耐药型别情况。3.SHV-1和SHV-11为两个主要进化节点,且存在由SHV-11→SHV-2a/SHV-31→SHV-12的多元进化路径,提示应加强耐药型别的连续性监测,预防与控制耐药基因的进一步传播及演变。
【图文】：

革兰阴性菌分布状况

SHV型β-内酰胺酶在革兰阴性杆菌中的分子特征及进化研究

ESBL表型确证试验
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5

【参考文献】