阿尔兹海默症基因诊断技术的探索开发

发布时间：2020-06-04 21:13

【摘要】：阿尔茨海默病(alzheimer's disease,AD)是一种神经退行性疾病,具有强烈的遗传倾向。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因组中单个核苷酸的变化引起的遗传物质(DNA)序列的多态性,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等都与SNP有关。本课题的目的是筛选一种稳定可靠地等温扩增技术,通过检测与AD相关基因SNP位点来设计阿尔海默症基因诊断试剂盒,从而对该疾病进行早期的诊断和预防。经过文献调研和前期实验结果,我们初步筛选出65个与AD相关的SNP位点,并重点探索了基于环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)的三种改进方法:1.智能等温扩增技术(Smart amplificaton prcoess,SMAP)利用非对称性引物设计和加入TaqMuts错配修复蛋白来抑制非特异性扩增,减少假阳性现象的发生。文中首先提取了人神经胶质瘤细胞株(U87)的基因组DNA,设计了鉴定基因ALDH2 rs671的引物组来验证了SMAP方法的可行性,对比发现分型结果与一代测序结果一致,而且数据显示TaqMuts错配修复蛋白具有明显减少非特异扩增的作用,只需15 min就可以观察到分型结果,40 min可以完成整个扩增过程。但是随后基因APOE rs429358的分型实验却并未成功。2.基于连接反应的环介导等温扩增技术(Ligation-Loop-Mediated Isothermal Amplification,L-LAMP)通过设计两条与目标序列互补的发夹探针,在Taq DNA连接酶的作用下两条探针可以形成哑铃状结构,该结构正好可以作为LAMP反应的中间产物启动LAMP反应。文中我们设计了针对rs429358位点两条发夹探针进行检测,但是实验结果并不稳定。经分析,实验过程可能出现了发夹探针错配或形成二聚体等现象导致连接反应失败或效率降低,从而影响LAMP反应的稳定性和准确度。3.改进的LAMP(Modified-Loop-Mediated Isothermal Amplification,M-LAMP)该方法引物设计明显简单,对SNP的检测效率和准确度也显著提高。文中我们设计了检测基因PICALM rs3851179和基因APOE rs429358的两组引物,数据显示扩增结果与测序结果一致。其中引物FIP和BIP除与靶序列互补的部分外5’端连接一段互补的回文序列,该互补的回文序列可以根据实际要求设计成通用序列,3’端是待测的SNP位点。与传统LAMP的产物积累方式不同,由于引物FIP和BIP的5’端特殊结构,形成的产物可以相互充当引物,进行下一轮扩增。这样扩增产物相互串联,最终形成大量靶序列的串联重复序列产物。结论:SMAP方法、L-LAMP方法在SNP检测方面存在一定局限,无法进行大规模地推广应用。相反,M-LAMP方法具有较高的特异性和稳定性,在引物设计、长片段的扩增、SNP检测方面都有明显的优势。M-LAMP方法作为一种新的核酸扩增技术或SNP检测技术,具有良好的应用前景。
【图文】：

阿尔茨海默病风险基因APP主要编码β-淀粉样蛋白前体蛋白（APP），PSEN1和PSEN2分别编码早

指数扩增技术的原理示意图一：（A）NASBA扩增方案
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.16;R440

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