冰冻血小板对肝巨噬细胞的活化作用与机制研究

发布时间：2020-06-05 10:44

【摘要】：临床血小板输注主要用于防治因血小板减少或血小板功能障碍引起的出血或潜在的严重出血。冰冻血小板一般是指以二甲基亚砜(DMSO)为保护剂冻存于-65~-80℃的血小板,与22℃振荡保存血小板相比,细菌污染风险小,保存期长达2年以上,虽然输入后不能有效提高血小板计数,但具有与新鲜血小板相同的止血能力,适于失血引起凝血功能障碍的治疗性输注。特别是2005年之后,美军医学研究所、荷兰军方血站先后改进了冰冻血小板的制备方法[1,2],采用O型血小板,加入DMSO后离心制成浓缩血小板约14ml,冻存于-80℃,输注前融化,用AB型新鲜冰冻血浆重悬。该方法的优点是(1)一个单位的冰冻血小板体积由原来的300ml浓缩至14ml左右,体积大为减小,便于储备运输;(2)AB血浆重悬后不需洗涤和交叉配血,直接输注给伤员,可实现快速施救。由此,该冰冻血小板(Cryopreserved platelets,CPPs)所具有的即刻止血效能和便于储备运输的勤务优势受到各国军方的重视,荷兰和比利时已将CPPs应用于军事行动和武装力量,美军将CPPs列入战时血液储备计划,并于2009年提交FDA审批,已完成I期临床研究[3]。目前,CPPs虽然受到各国军方关注,但尚未在任何国家通过审批成为正式的血液制品,安全性研究是延迟其临床应用的主要原因。血小板除了具有止血功能以外,还介导炎症反应和免疫调节[4,5],因此血小板输注除了关注其止血效果,还需明确其可能带来的不良反应。近期在澳大利亚、捷克、美国已经开展CPPs可行性和安全性的临床试验,但实验研究尚未完成,无明确结论[3]。本课题组前期采用小鼠失血模型,比较新鲜血小板、常温储存血小板和CPPs输注对组织损伤的影响,发现CPPs组肝巨噬细胞(Kuffer cells,KCs)数量和炎性因子释放显著高于其他两组[6]。在肝缺血再灌研究中,血小板输注加重肝损伤主要与KC细胞相关[7]。由此,我们推测冰冻血小板与KC的相互作用是促进肝损伤的重要环节。本研究即采用人单采去白血小板与佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导的人单核巨噬细胞THP-1细胞,体外研究CPPs对THP-1细胞的激活作用,探讨其可能的作用机制。本研究分三部分,以22℃和4℃储存血小板作为对照,研究-80℃保存血小板与THP-1相互作用的重要分子表达,为后续实验提供思路;明确-80℃血小板储存的损伤特点。其次,以22℃和4℃储存血小板作为对照,研究-80℃保存血小板与THP-1细胞的吞噬与活化作用;最后,封闭可能的重要分子,检测THP-1细胞对CPPs的吞噬的影响,及CPPs与THP-1细胞共孵育后炎性因子释放的影响,探讨重要分子在介导CPPs与THP-1细胞活化中的作用第一章:不同储存温度对血小板损伤的比较研究目前研究认为常温(22℃)保存血小板输注加重肝缺血再灌损伤,4℃保存血小板通过糖蛋白GPIbα的簇集,促进与KC表面受体Mac-1的结合,导致被KC细胞快速清除。然而,针对-80℃保存血小板与KC细胞相互的作用研究未见文献报道。本研究以22℃和4℃血小板作为对照,探究-80℃保存血小板在储存过程中血小板形态、表面活性分子的改变,炎性因子的释放等,探讨-80℃保存血小板的低温损伤特点,分析推测介导CPPs与THP-1相互作用的重要分子,同时为研究低温血小板的损伤、凝血和体内清除机制,及临床血小板的选择提供实验参考。研究方法:每单位单采去白血小板分为3份,分别于22℃振荡保存,4℃静置保存和依照荷兰军方冰冻血小板的制备方法-80℃冻存。于不同保存时间测定血小板平均体积(MPV),分布宽度(PDW);检测试剂盒测定乳酸(Lac)和乳酸脱氢酶(LDH)含量;流式细胞术检测血小板表面糖蛋白GPIbα表达与结构变化,P-选择素(P-selectin)和PS表达;采用ELISA方法测定血浆中s CD40L和RANTES的含量。结果表明:4℃保存血小板随保存时间延长,各指标变化明显,而-80℃冻存过程对各指标的影响较大,在冻存1-28d内变化不显著。与22℃保存血小板相比,4℃保存血小板P-selectin、GPIbα末端N-乙酰基葡萄糖胺(β-Glc NAc)数量、PS阳性率较高(P0.05),s CD40L表达低(7d)(P0.05,);MPV和LDH值略高、Lac值略低,但差异不显著。与4℃和22℃保存的相比,-80℃保存显著增加血小板MPV、LDH值和PS表达阳性率(P0.05),显著降低GPIbα表达和Lac含量(P0.05);-80℃保存血小板P-selectin表达高于保存1d、低于保存7d的22℃保存血小板(P0.05),低于保存3d的4℃保存血小板(P0.05);-80℃保存血小板s CD40L和RANTES含量低于4℃保存10d的血小板(P0.05)。小结:与22℃血小板相比,4℃保存不加重血小板膜损伤,但促进血小板活化与凋亡;-80℃保存严重损伤血小板膜,显著降低血小板GPIbα表达,促进PS和P-selectin表达,抑制代谢与炎性因子释放;-80℃保存血小板s CD40L和RANTES释放、GPIbα表达显著低于4℃保存血小板,而PS的表达则显著高于4℃保存血小板,提示两者对KC细胞的作用方式不同,推测冰冻血小板表达的PS和P-selectin可能是介导血小板与KC相互作用的主要分子。第二章:冰冻血小板对THP-1的活化作用在前期研究工作中,我们给重度失血小鼠输注新鲜、常温储存和CPPs,发现CPPs输注加重肝损伤,肝脏巨噬细胞数量和炎性因子释放显著高于新鲜和常温储存血小板输注。为了进一步明确CPPs与巨噬细胞的相互作用,本研究采用PMA诱导的THP-1细胞,体外检测人单采去白血小板冰冻保存后与THP-1细胞的吞噬与活化作用。研究方法:采用PMA诱导THP-1细胞,通过细胞形态分析,吞噬能力检测和表面标志CD11b和CD14的表达,确定PMA的诱导条件;采用不同浓度的LPS预活化THP-1细胞,与CPPs共孵育后检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)表达,以无血小板与THP-1共孵育作为对照,确定合适的LPS预活化条件;将不同温度储存3d的三种血小板(22℃,4℃,-80℃)与THP-1细胞共孵育,通过荧光共聚焦和流式细胞术检测THP-1细胞对血小板的吞噬,ELISA方法检测血小板与THP-1细胞共孵育后TNF-α、IL-6、IL-1β和转化生长因子-β(TGF-β)的表达。结果表明:THP-1的诱导条件为:25ng/ml PMA诱导24h,无PMA继续培养48h。该条件下,THP-1贴壁牢固,部分细胞呈长梭形,伸出伪足。吞噬能力较强为80%,CD11b和CD14表达阳性率均接近100%,表达量较高;随着LPS浓度的增高,实验组和对照组表达TNF-α、IL-6和IL-1β均逐渐增加。当以0.5ng/ml的LPS的刺激THP-1细胞3h时,实验组TNF-α、IL-6和IL-1β表达显著高于对照组,且两组炎性因子浓度差值较大;THP-1细胞对-80℃保存血小板的粘附与吞噬率显著高于22℃和4℃保存血小板(P0.05);-80℃保存血小板与THP-1共孵育后炎性因子TNF-α,IL-1,IL-6和TGF-β的表达显著高于22℃和4℃保存血小板(P0.05);血小板与THP-1细胞共孵育表达的TNF-α,IL-1,IL-6和TGF-β水平,LPS预活化组显著高于无LPS预活化组(P0.05)。小结:确定THP-1细胞的诱导条件;在优化的LPS预活化条件下,THP-1细胞即被轻度活化,又不会掩盖血小板对THP-1细胞的激活作用;证实与22℃和4℃保存血小板相比,-80℃保存血小板更易被THP-1细胞吞噬,同时促进THP-1细胞产生更高水平的炎性因子;LPS预活化THP-1细胞促进了血小板对THP-1细胞的活化作用。第三章:冰冻血小板促进THP-1细胞活化的机制根据以上实验结果,我们推测CPPs表面PS和P-selectin表达的增加是介导血小板被THP-1细胞吞噬,及促进THP-1活化的重要途径。本研究采用Annexin-V和P-selectin抗体(Anti-P-selectin)来封闭血小板表面的PS和P-selectin,检测THP-1细胞对CPPs的吞噬的影响,及CPPs与THP-1细胞共孵育后炎性因子释放的影响,探讨血小板表面PS和P-selectin在介导CPPs与THP-1细胞活化中的作用。研究方法:分别采用0、0.5、1、2、4、8、16μg/ml的Annexin-V和Anti-P-selectin加入冰冻血小板中预封闭血小板表面PS和P-selectin,随后与THP-1细胞共孵育,采用荧光共聚焦和流式细胞术检测THP-1细胞对血小板的吞噬情况,ELISA方法检测CPPs与THP-1细胞共孵育后TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β的表达。结果表明:随着Annexin-V和Anti-P-selectin浓度的增高,THP-1细胞对CPPs的吞噬逐渐降低,抑制率分别可达60%和20%;2μg/ml的Annexin-V或4μg/ml的Anti-P-selectin可以抑制冰冻血小板与THP-1细胞共孵育后促炎因子TNF-α,IL-1β,IL-6的表达,并促进抑炎因子TGF-β的表达。对比Annexin-V和Anti-P-selectin的作用效果,2μg/ml Annexin-V的抑制效果更显著。小结:初步证实CPPs表面PS外翻和P-selectin高表达是介导血小板被THP-1细胞吞噬,及促进THP-1炎性因子释放的重要分子。通过以上研究,我们首次证实了与22℃和4℃保存血小板相比,CPPs表面更易被巨噬细胞吞噬;与4℃保存血小板通过GPIbα高表达与簇集介导血小板被巨噬细胞吞噬不同,CPPs表面PS大量外翻和P-selectin高表达是血小板被巨噬细胞吞噬的主要原因;与22℃和4℃保存血小板相比,CPPs促进巨噬细胞释放更多的炎性因子;巨噬细胞对CPPs的大量吞噬促进巨噬细胞的活化,血小板表面大量PS外翻在此过程中发挥更加重要的作用。通过本研究,我们初步证实了血小板冰冻保存后,增强了与巨噬细胞的吞噬与活化作用,从而促进巨噬细胞的炎症反应,加重炎性损伤。提示在失血造成一次打击的情况下,输注CPPs后,需要关注肝脏不良反应的发生。
【图文】：

血小板,储存过程

1.3.1 血小板样本依照临床单采血小板的采集标准进行采集，初检质量合格，每人份血小板计数可达为 700-800×109/L。1.3.2 血小板储存过程中 MPV 和 PDW 的改变与 22℃常规储存血小板相比，4℃和-80℃血小板随时间变化其 MPV 变化情况见图 1.1A，PDW 变化情况见图 1.1B。变化指数各检测点 MPV 和 PDW 与 22℃血小板的比值。由图 1.1A 可知，22℃保存血小板在保存期内（1-7d）MPV 随时间变化逐渐升高，，但在 7d 之后显著升高；与 22℃血小板相比，4℃保存血小板在保存 1-7d 其 MPV 值也逐渐升高，且略高于 22℃保存的血小板；从储存第 1d的测定值来看，4℃和-80℃血小板均高于 22℃血小板，且保存 1-28d 的-80℃血小板组 MPV 值显著高于保存 1-7d 的 22℃血小板；在保存第 21d 时，4℃血小板MPV 值显著高于-80℃保存的血小板；血小板冻融过程显著增加 MPV 值，但 MPV值受保存时间的影响不大。由图 1.1B 可见，-80℃保存 28d 以内与 22℃保存 1-7d的 PDW 相比无显著改变；4℃保存 10d 之后 PDW 明显增加。

血小板,储存过程,4℃保存,保存时间

军事科学院硕士学位论文1.3.3 血小板储存过程中 LDH 和 Lac 的改变三种不同储存方式血小板在储存过程中 LDH 变化情况见图 1.2A，Lac 变化情况见图 1.2B。由图 1.2A 可见，22℃血小板与 4℃保存的血小板类似，随保存时间延长 LDH产生增多，变化趋势无显著区别；-80℃冻融处理（保存 1d）后 LDH 较 4℃和22℃血小板显著增加，为 0d 新鲜血小板的 2-3 倍，但随保存时间的延长（1-28d）LDH 无显著变化。由图 1.2B 可知，与 22℃血小板类似，4℃保存的血小板随保存时间延长 Lac 产生增多，两者无显著差别；-80℃保存 1-28d 内 Lac 浓度显著低于 22℃和 4℃保存的血小板，差异有统计学意义，且随时间延长其 Lac 浓度无明显改变。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R457.1

【参考文献】