S1PR3特异性激动剂RY-15通过ERK通路磷酸化促进巨噬细胞细菌清除作用的研究

发布时间：2020-06-08 23:59

【摘要】：研究背景:脓毒症(Sepsis)是一种临床上由机体对感染的异常反应而导致的危及生命的器官功能障碍,是严重烧、创伤及外科大手术后常见的并发症。最新数据显示,全球每年超过1900万人罹患脓毒症,其中死亡人数超过530万,是重症监护室(intensive care unit,ICU)患者的首位死亡原因。前期我们团队已完成了关于中国脓毒症流行病学现状的前瞻性调查,结果显示我国重症脓毒症的发病率为8.68%,与欧美国家相当,这些重症患者住院期间死亡率高达50%。因此,探索脓毒症的防治对策具有极其重要的临床意义。脓毒症的发病机制十分复杂,病原微生物感染和机体炎症反应是其病理生理学基础。病原微生物感染及机体持续的炎症反应可以导致脓毒症患者组织器官损伤,继而发生急性呼吸窘迫综合征甚至脓毒性休克、多脏器功能衰竭等,导致机体对病原微生物清除能力下降。如若未能控制病情,过度的炎症反应会消耗大量的细胞因子及炎症介质,导致机体免疫抑制,使得病原微生物大量繁殖,病情恶化甚至死亡。所以,早期控制并且有效清除病原微生物,已成为降低重症脓毒症如多脏器功能衰竭、弥漫性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)等发生率和提高脓毒症生存率的关键。病原微生物入侵机体时,固有免疫系统首先作出快速免疫应答反应。巨噬细胞作为机体固有免疫反应中的关键效应细胞,其功能变化在脓毒症早期免疫治疗中受到高度关注。巨噬细胞发挥抗感染效应的方式主要为三步:形成吞噬体摄取病原微生物,吞噬体成熟获得抗菌能力,分泌细胞因子招募炎性细胞至感染部位进一步清除病原微生物。ERK信号通路作为MAPK三个亚型之一参与其中。S1P 受体(sphingosine 1-phosphate receptors,S1 PRs)是一种 G 蛋白偶联受体,广泛分布于心肌细胞、内皮细胞、神经细胞及巨噬细胞、T细胞等免疫细胞,是目前脓毒症non-TLRs研究的一个热点。S1PRs与磷脂分子1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)结合,启动细胞跨膜信号转导,调节细胞增殖、凋亡、血管生成和炎症反应。S1PR3是S1PRs家族的一个重要成员,与三种G蛋白(Gi、Gq、G12/G13)发生偶联,激活下游PI3K/Akt、MAPK等信号通路,一方面介导巨噬细胞向炎症病灶募集并释放炎症因子,另一方面介导巨噬细胞清除细菌。既往研究证实,S1PR3基因敲除组小鼠腹腔感染大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)及盲肠结扎穿孔(cecum ligation and puncture,CLP)诱导的脓毒症模型后,生存率较野生组小鼠显著降低,血液、肺、脾及肝的细菌负荷增加,并证实“S1PR3-G protein-Vps34-NOX2/EEA1信号通路”参与S1PR3调控巨噬细胞吞噬体的功能。既往临床研究也表明,ICU脓毒症死亡患者的S1PR3 mRNA表达水平较脓毒症存活患者显著降低,重症脓毒症患者血液中S1P(S1PR3受体的配体物质)的浓度明显低于其他脓毒症患者及健康志愿者,体内S1P的低水平状态与脓毒症患者病死率相关。因此我们推测,在脓毒症早期应用特异性激动S1PR3的药物将是脓毒症治疗的新策略。研究目的:既往研究证明,KRX-725是同源于S1PR3胞内第二个环的含9个氨基酸序列(1 43M-R-P-Y-D-A-N-K-R151)组成并经修饰后的短肽,可特异性激活S1PR3,增强巨噬细胞细菌清除作用,改善脓毒症预后,但其跨膜入胞时间较长,药物本身的氨基酸序列的稳定性不足。本研究对KRX-725进一步优化,合成新一代的S1PR3特异性激动剂即RY-15,并研究其促进巨噬细胞清除细菌的作用及机制,为临床转化研究提供实验室依据。研究方法:KRX-725是同源于S1PR3胞内第二个环的含9个氨基酸序列的短肽,该短肽可以特异性激活S1PR3,增强巨噬细胞细菌清除作用,改善脓毒症预后。在此基础上,我们对该肽的结构进一步优化,并研究其入胞、清除细菌能力及对THP-1细胞ERK通路的磷酸化水平。研究结果:1.人工合成S1PR3特异性激动剂的分子式GY-5、RY-15。2.激光共聚焦显微镜观察显示,RY-15作用THP-1细胞10min后,开始入胞;30min后,入胞效果显著。3.庆大霉素保护实验发现,RY-15可以显著降低细菌被吞噬后巨噬细胞内存活的大肠杆菌数量(p0.05),而GY-5则对巨噬细胞清除细菌作用没影响。4.Western Blot实验结果显示,GY-5、RY-15均可以使ERK通路磷酸化,而RY-15对其活化的作用更显著。研究结论:S1PR3特异性激动剂RY-15可以进入到细胞内,促进巨噬细胞清除细菌,这一作用可能是通过ERK通路磷酸化来实现的。
【图文】：

抗原分子（ｅａｒｌｙ邋ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋１，，ＥＥＡ１邋）、溶酶体相关膜蛋白邋１邋（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－逡逑ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１，邋ＬＡＭＰ１邋），邋从而促进吞嗤溶酶体的成熟邋，具备完整的逡逑杀菌功能（具体机制见图１．１）邋［１４］。既往临床研究也表明，ＩＣＵ脓毒症死亡患者的逡逑Ｓ１ＰＲ３邋ｎｉＲＮＡ表徶水平较脓毒症存活患者显著降低，重症脓毒症患者血液中Ｓ１Ｐ逡逑（Ｓ１ＰＲ３受体的配体物质）的浓度明显低于其他脓毒症患者及健康志愿者，体内逡逑Ｓ１Ｐ的低水平状态与脓毒症患者病死率相关１１５］。因此我们推测，在脓毒症早期应用逡逑特异性激动Ｓ１ＰＲ３药物将是脓毒症治疗的新策略。逡逑Ｓ１ＰＲ３＾＾＾＾－邋0邋0°邋0°邋00邋Ａｃｔｉｖａｔｏｒ邋（ｅ．ｇ．，Ｓ１Ｐ）逡逑（Ｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋）逡逑，＇ｒ＿Ｐ邋广．．逡逑Ｅａｒｌｙ逦（邋／＇逡逑ｐｈａｇｏｓｏｍｅ邋＼逦Ｊ邋Ｊ逦Ｉ逡逑ＮＯＸ２邋ｐｔｄ丨ｎｓ（３＞§｜：：邋ＥＥＡ１逦／逡逑＾逦／逡逑Ｏｘｙｇｅｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ａｎｄ邋ｏｘｙｇｅｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ逦／逡逑ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ逦／逡逑图１．１邋Ｓ１ＰＲ３介导巨噬细胞杀菌机制逡逑（见于本课题组前期研究：Ａｍ邋ＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔ邋Ｃａｒｅ邋Ｍｅｄ，２０１７，１９６（１２）：邋１５５９－１５７０．）逡逑３逡逑

为检测Ｓ１ＰＲ３特异性激动剂ＲＹ－１５的入胞效果，将带ＦＩＴＣ荧光染料的ＲＹ－１５与逡逑ＴＨＰ－１细胞系于３７°Ｃ、５％Ｃ０２培养箱中共培养５ｍｉｎ、ｌＯｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ后，用逡逑激光共聚焦显微镜观察并拍照，如图３．１。结果显示，ＲＹ－１５作用ＴＨＰ－１细胞１０邋ｍｉｎ逡逑后，开始入胞；３０ｍｉｎ后，入胞效果显著。逡逑１２逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R459.7

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本文编号：2703856