基于单细胞质谱流式技术研究慢性移植物抗宿主病患者的免疫图谱

发布时间：2020-06-16 12:34

【摘要】：研究背景:慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease,cGVHD)是引起异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)患者无复发死亡最常见并发症,可累及全身各个组织和器官,并且严重影响allo-HSCT长期存活患者的生存质量和重返社会的能力[1,33]。约30%-70%的allo-HSCT患者会发生cGVHD[2,15]。目前,由于cGVHD的免疫细胞和分子机制尚不明确,因此对cGVHD的有效预防与治疗进展缓慢。既往,对于参与cGVHD病理过程的免疫细胞的研究一般采用流式细胞技术。传统流式细胞仪,是基于荧光发射的检测系统,不同的荧光基团发射光谱存在重叠现象,因此,目前可同时检测的荧光信号标记一般少于15个,同时信号标记之间容易互相干扰,这在一定程度上影响了实验的准确性。目前新兴的质谱流式细胞技术(cytometry by time-of-flight,CyTOF)),以在细胞中含量极低的镧系金属代替传统的荧光蛋白来标记抗体,由于无需校正光谱的重叠干扰,可以同时检测单个细胞的最多100个标记,因此成为研究复杂免疫系统的有效手段。通过质谱流式细胞技术,我们能够从广度、深度研究参与cGVHD病理生理过程的免疫细胞亚群及其相应特征,为进一步揭示慢性移植物抗宿主病的发病机制提供新思路。目的:本研究为明确cGVHD患者的免疫细胞图谱,通过质谱流式技术深入分析免疫细胞亚群失衡在慢性移植物抗宿主病发生发展中的作用,从而进一步探索靶向特定免疫机制的慢性移植物抗宿主病治疗新策略。方法:(1)确定单细胞质谱流式细胞技术实验所需的42种免疫标记,初步构建上机方案,前期采集检测样本,单细胞质谱流式细胞仪进行分析,检测抗体质量,质检通过后正式构建慢性移植物抗宿主病CyTOF检测人体免疫试剂盒(包含42种CyTOF抗体,包括T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、DC细胞、浆细胞和粒细胞、髓系细胞等细胞亚群标记);(2)接受allo-HSCT患者按照NIH诊断及分型标准分为无cGVHD患者组、中度cGVHD患者组、重度cGVHD患者组,同时按照病人cGVHD累及器官分为以皮肤cGVHD症状为主患者组和以肺部cGVHD症状为主患者组;(3)临床上收集异基因造血干细胞移植术后患者外周血标本31例,记录详细病程信息,同时收集健康捐献者外周血标本5例,所有参与研究者均需排除感染情况和自身免疫性疾病,空腹抽取静脉血10ml,EDTA抗凝,24小时内密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,每个待检测样本选取3×106个外周血单个核细胞染色质谱流式上机检测,剩余细胞-80摄氏度冰箱冷冻24小时后转入液氮中保存;(4)上机检测所得数据统计分析,进行后续实验。生物信息学方法:(1)原始数据预处理及质量控制:对数据进行标准化预处理,并去除批次等噪音影响,得到单个、活的、免疫细胞的有效数据进行下一步分析;(2)聚类分析:选择上机方案中指定的信号标记,采用xshift聚类算法进行分析;当单个文件细胞数量过大时,对数据采用随机降采样的方法以减少细胞数并同时不加入人为操作偏差。通过高性能的聚类算法获得对样本的免疫细胞亚群的分类(cluster);(3)聚类结果统计学分析及可视化展示:采用基于t分布随机领域嵌入(t-distributed stochastic neighbor embedding,t-SNE)的降维可视化方法对所获得的聚类结果进行可视化,并获得可视化随机网络嵌入(visual stochastic network embedding,viSNE)、热图(heatmap)等可视化展示;同时,对各样本中每个亚群的百分比(Frequency)进行差异性分析,根据病人临床信息,对样本进行分组,采用双边t检验的方法确认不同组别之差异性表达的特征免疫亚群。结果:(1)自2017年11月-2018年12月共收集31例异基因造血干细胞移植后患者外周血样,其中12例患者未发生cGVHD,7例患者发生中度cGVHD,12例患者发生重度cGVHD。在19例发生中度-重度cGVHD患者中,10例患者以皮肤cGVHD症状为主要临床表现,6例患者主要表现为肺部cGVHD症状,3例患者同时出现皮肤与肺部cGVHD症状;(2)通过质谱流式检测各分组患者外周血单个核细胞的细胞亚群组成和免疫表型,我们发现,中-重度cGVHD患者组与无cGVHD患者组相比,具有不同的细胞亚群分布图谱;(3)以肺部症状为主cGVHD患者组与无cGVHD患者组相比,具有不同的细胞亚群分布图谱;(4)以皮肤症状为主cGVHD患者组与无cGVHD患者组相比,具有不同的细胞亚群分布图谱;(5)中度cGVHD患者的外周血中骨髓来源抑制细胞的比例高于无cGVHD患者组,重度cGVHD患者的外周血中单核吞噬细胞的比例高于无cGVHD患者组;(6)以肺部症状为主cGVHD患者的外周血中两群特异的T细胞亚群(C5,C21)的比例高于无cGVHD患者组和以皮肤症状为主cGVHD患者组;(7)小鼠异基因骨髓移植模型构建后流式细胞术检测移植嵌合度,得到H2-Kb阳性细胞所占百分比超过90%,检测结果为完全嵌合,小鼠异基因骨髓移植模型建立成功;(8)小鼠cGVHD模型流式检测发现cGVHD严重程度与外周血CD11b+髓系细胞群的比例成正相关关系。结论:(1)骨髓来源抑制细胞与单核吞噬细胞可能与cGVHD的病理机制有关;(2)两群T细胞亚群可能参与肺部cGVHD的病理过程;(3)小鼠cGVHD模型证实CD11b+髓系细胞群可能与cGVHD的病理机制有关。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R457.7
【图文】：

患者,肺部,症状,聚类分析

ｃＧＶＨＤ患者组相比具有不同的细胞亚群分布图谱逡逑通过ＣｙＴＯＦ检测发现６例以肺部症状为主ｃＧＶＨＤ患者与１２例无ｃＧＶＨＤ逡逑患者相比，外周血单个核细胞具有不同的细胞亚群分布图谱（图２）。逡逑ＡＢＣ逡逑图２，无ｃＧＶＨＤ患者组与以肺部症状为主ｃＧＶＨＤ患者组聚类分析后ｖｉＳＮＥ对比。图Ａ为逡逑无ｃＧＶＨＤ患者组聚类分析后ｖｉＳＮＥ图，图Ｂ为以肺部症状为主ｃＧＶＨＤ患者组聚类分析逡逑后ｖｉＳＮＥ图，图Ｃ为无ｃＧＶＨＤ患者组与以肺部症状为主ｃＧＶＨＤ患者组聚类分析后ｖｉＳＮＥ逡逑对比图。可通过对比发现部分差异细胞亚群。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２

患者,聚类分析

逡逑ｃＧＶＨＤ患者相比，外周血单个核细胞具有不同的细胞亚群分布图谱（图３）。逡逑ＡＢＣ逡逑图３，无ｃＧＶＨＤ患者组与以皮肤症状为主ｃＧＶＨＤ患者组聚类分析后ｖｉＳＮＥ对比。图Ａ为逡逑无ｃＧＶＨＤ患者组聚类分析后ｖｉＳＮＥ图，图Ｂ为以皮肤症状为主ｃＧＶＨＤ患者组聚类分析逡逑后ｖｉＳＮＥ图，图Ｃ为无ｃＧＶＨＤ患者组与以皮肤症状为主ｃＧＶＨＤ患者组聚类分析后ｖｉＳＮＥ逡逑对比图。可通过对比发现部分差异细胞亚群。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ３

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